張議文，王江濤*，譚麗菊

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島，266100）

旋鏈角毛藻對(duì)中肋骨條藻化感作用的影響因素及化感物質(zhì)性質(zhì)初探

張議文1，王江濤1*，譚麗菊1

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋化學(xué)理論與工程技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島，266100）

在已知旋鏈角毛藻對(duì)中肋骨條藻具有化感作用的前提下，進(jìn)行了溫度、生長(zhǎng)時(shí)期、光照、細(xì)菌等因素對(duì)旋鏈角毛藻化感作用的影響、化感物質(zhì)的萃取及粗提物對(duì)中肋骨條藻的化感效應(yīng)檢驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)，研究了旋鏈角毛藻化感物質(zhì)的性質(zhì)、降解特點(diǎn)，并初步測(cè)定了化感物質(zhì)的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：旋鏈角毛藻化感作用與生長(zhǎng)時(shí)期有關(guān)，指數(shù)期濾液化感作用強(qiáng)于衰亡期；旋鏈角毛藻的化感物質(zhì)在50℃以下保持穩(wěn)定，光和細(xì)菌均引起旋鏈角毛藻化感物質(zhì)的降解，且細(xì)菌降解強(qiáng)于光降解；旋鏈角毛藻的乙酸乙酯萃取物具有明顯的化感活性，該萃取物在255～260 nm處有特征吸收峰。綜合以上結(jié)果，推測(cè)旋鏈角毛藻化感物質(zhì)可能為分解溫度在50℃以上的易被光和細(xì)菌降解的苯衍生物，從極性上看較易溶于乙酸乙酯。

化感物質(zhì)；旋鏈角毛藻Chaetoceros curvisetus；中肋骨條藻Skeletonema costatum

1 引言

化感作用是指植物、藻類(lèi)、細(xì)菌、真菌通過(guò)次級(jí)代謝產(chǎn)物影響生態(tài)系統(tǒng)的發(fā)展和演變的過(guò)程［1］。近年來(lái)隨著赤潮頻發(fā)，浮游植物間的化感作用越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。已有很多研究發(fā)現(xiàn)浮游植物間存在化感作用，并認(rèn)為浮游植物通過(guò)釋放胞外化感物質(zhì)進(jìn)行種間競(jìng)爭(zhēng)是浮游植物群落發(fā)展演變及赤潮暴發(fā)、優(yōu)勢(shì)種演替的原因之一［2－3］。例如Liu等［4］研究發(fā)現(xiàn)化感作用是球形棕囊藻對(duì)海洋卡盾藻和卵圓褐胞藻獲取競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的主要原因。Yamasaki等［5］發(fā)現(xiàn)中肋骨條藻濾液抑制赤潮異灣藻的生長(zhǎng)，并推測(cè)相關(guān)的化感物質(zhì)與中肋骨條藻赤潮中藻類(lèi)的演替有關(guān)。王江濤等［6］發(fā)現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)鹽不足條件下，中肋骨條藻濾液會(huì)對(duì)自身產(chǎn)生抑制作用，化感作用可能影響中肋骨條藻和東海原甲藻的競(jìng)爭(zhēng)和演替。

化感物質(zhì)是浮游植物對(duì)競(jìng)爭(zhēng)者產(chǎn)生促進(jìn)或抑制作用的媒介，在環(huán)境脅迫的壓力下，化感物質(zhì)的產(chǎn)生量與釋放量會(huì)增加，以提高化感作用物種的競(jìng)爭(zhēng)能力。自然環(huán)境中，許多非生物因素和生物因素會(huì)影響化感物質(zhì)的分泌，也干擾化感物質(zhì)對(duì)目標(biāo)藻的作用，其中，非生物因素主要有光照、p H、溫度、營(yíng)養(yǎng)鹽等，生物因素包括細(xì)胞密度、生長(zhǎng)時(shí)期、生物降解過(guò)程等［3］。盡管化感作用的研究日益廣泛，但是由于很難對(duì)濾液中的有效化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分離和純化，目前化感物質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能仍存在很多未知。在前期實(shí)驗(yàn)中，我們已發(fā)現(xiàn)化感作用是旋鏈角毛藻抑制中肋骨條藻生長(zhǎng)的途徑之一，旋鏈角毛藻通過(guò)產(chǎn)生與釋放胞外活性物質(zhì)（即化感物質(zhì)）到周?chē)w環(huán)境中而獲得相比中肋骨條藻更好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)［7］。本文以此為前提，進(jìn)行了溫度、生長(zhǎng)時(shí)期、光照、細(xì)菌等因素對(duì)旋鏈角毛藻化感物質(zhì)的影響及化感物質(zhì)的提取實(shí)驗(yàn)，研究了旋鏈角毛藻化感物質(zhì)的降解特點(diǎn)、性質(zhì)和初步結(jié)構(gòu)，從而為進(jìn)一步提取旋鏈角毛藻化感物質(zhì)、探討化感作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 微藻培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)藻種中肋骨條藻和旋鏈角毛藻，均取自中國(guó)海洋大學(xué)海洋污染生態(tài)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室藻種室，培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，光暗比為12 h∶12 h，光照度4 000 lx。每天定時(shí)搖晃培養(yǎng)瓶并重新隨機(jī)排放，以排除任何光或溫度不同造成的影響。每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行樣。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 溫度對(duì)旋鏈角毛藻化感作用的影響

取旋鏈角毛藻指數(shù)末期的培養(yǎng)液，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，得到無(wú)藻細(xì)胞濾液。分別置于50℃、90℃水浴中加熱半小時(shí)，冷卻后測(cè)定NO3-N，NO2-N，NH4-N，PO4-P，SiO4-Si五項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)鹽指標(biāo)，測(cè)定方法分別為鋅-鎘還原法、重氮-偶氮法、次溴酸鈉氧化法、磷鉬藍(lán)分光光度法和硅鉬藍(lán)分光光度法［8］。已知營(yíng)養(yǎng)鹽濃度的旋鏈角毛藻無(wú)藻細(xì)胞濾液和滅菌海水均加富至f／2培養(yǎng)基，接種中肋骨條藻。中肋骨條藻初始藻密度為8×104個(gè)／mL，每天定時(shí)取樣用于CASY細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。

2.2.2 生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)旋鏈角毛藻化感作用的影響

分別取旋鏈角毛藻的指數(shù)期和衰亡期培養(yǎng)液，藻密度均為1.9×106個(gè)／m L，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾得到濾液，測(cè)定五項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)鹽指標(biāo)（方法同2.2）后，加富至f／2培養(yǎng)基，以滅菌海水為對(duì)照，培養(yǎng)中肋骨條藻。中肋骨條藻初始藻密度為8×104個(gè)／m L，每天定時(shí)取樣用于顯微鏡計(jì)數(shù)和Fv／Fm（PSⅡ的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量）測(cè)定。

2.2.3 光和細(xì)菌對(duì)旋鏈角毛藻化感作用的影響

取旋鏈角毛藻衰亡期無(wú)藻濾液，分兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，一組避光保存，一組每天定時(shí)添加濃度為0.5 mg／L的鏈霉素、多粘菌素B，另設(shè)一實(shí)驗(yàn)組為添加同等濃度抗生素的滅菌海水。放置20 d后，測(cè)定五項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)鹽指標(biāo)，以新鮮衰亡期濾液和新鮮滅菌海水為對(duì)照組，均加富至f／2培養(yǎng)基。中肋骨條藻初始藻密度為8×104個(gè)／m L，定時(shí)取樣用于顯微鏡計(jì)數(shù)和Fv／Fm測(cè)定。

2.2.4 旋鏈角毛藻濾液化感物質(zhì)粗提及粗提物對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的影響

滅菌海水中分別添加1%二甲亞砜（DMSO）、乙醚、乙酸乙酯、正已烷，以滅菌海水為空白對(duì)照，按f／2培養(yǎng)基添加營(yíng)養(yǎng)鹽，接種中肋骨條藻，初始藻密度為1.2×105個(gè)／m L，每天定時(shí)取樣用于CASY細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。

取指數(shù)末期旋鏈角毛藻濾液，分別用乙醚、乙酸乙酯、正已烷萃取，取有機(jī)相旋蒸（加熱溫度均為45℃以下），經(jīng)DMSO溶解，用滅菌海水定容至原體積。按f／2培養(yǎng)基添加營(yíng)養(yǎng)鹽，中肋骨條藻初始藻密度為1.2×105個(gè)／m L，每天定時(shí)取樣用于CASY細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。

2.2.5 乙酸乙酯提取物的紫外光譜掃描

取指數(shù)期旋鏈角毛藻濾液的乙酸乙酯提取物，在UV2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上，進(jìn)行200～400 nm紫外-可見(jiàn)全光譜掃描，以確定化感物質(zhì)的特征吸收。

以人工海水作參比，在最大吸收峰處測(cè)定旋鏈角毛藻指數(shù)期濾液的吸光度。

2.3 數(shù)據(jù)處理

2.3.1 相對(duì)抑制率（IR）采用下式計(jì)算每一天對(duì)生物量的相對(duì)抑制率［8］：

IR（%）=（1－T／C）×100%，

式中，IR為相對(duì)抑制率，T為實(shí)驗(yàn)組生物量，C為對(duì)照組生物量。

2.3.2 顯著性檢驗(yàn)

通過(guò)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組的平行樣計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）。各組間的顯著性差異用one-way ANOVA進(jìn)行分析［9］。p＜0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 溫度對(duì)化感作用的影響

旋鏈角毛藻濾液經(jīng)50℃、90℃加熱處理后，分別測(cè)定各項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)鹽，由結(jié)果可知，加熱后濾液中各溶解態(tài)營(yíng)養(yǎng)鹽濃度均增加，經(jīng)90℃加熱處理的實(shí)驗(yàn)組，與其他兩組實(shí)驗(yàn)相比，硅酸鹽濃度明顯增加（見(jiàn)表1）。據(jù)已知濾液濃度，將濾液加富至f／2培養(yǎng)基，同時(shí)以加富至f／2培養(yǎng)基的滅菌海水為對(duì)照組，排除營(yíng)養(yǎng)鹽濃度不同對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，根據(jù)中肋骨條藻細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，繪制生長(zhǎng)曲線（圖1）并計(jì)算相對(duì)抑制率（圖2），以研究加熱分解對(duì)旋鏈角毛藻的化感作用的影響。

表1 不同熱處理?xiàng)l件下旋鏈角毛藻濾液營(yíng)養(yǎng)鹽濃度

從圖1和圖2可以看出，50℃加熱處理藻液與未處理藻液中，中肋骨條藻藻密度無(wú)差異（p=0.87），與海水對(duì)照組相比均顯示了抑制作用，48 h時(shí)抑制率達(dá)到最大值，分別為65%和60%。濾液經(jīng)90℃加熱，仍表現(xiàn)有一定的抑制作用，但抑制率小于另外兩組，說(shuō)明經(jīng)90℃加熱處理后，旋鏈角毛藻濾液中的化感物質(zhì)部分失活，導(dǎo)致旋鏈角毛藻對(duì)中肋骨條藻的化感作用減弱。而加熱至50℃對(duì)旋鏈角毛藻濾液的抑制效果無(wú)影響，即50℃時(shí)旋鏈角毛藻化感物質(zhì)是穩(wěn)定的。在以后的提取實(shí)驗(yàn)中，為保證提取效率，加熱溫度控制在50℃以下。

圖1 中肋骨條藻在不同加熱處理的旋鏈角毛藻濾液中的生長(zhǎng)曲線

圖2 中肋骨條藻在不同加熱處理的旋鏈角毛藻濾液中的相對(duì)抑制率

3.2 生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)化感作用的影響

圖3顯示了在不同生長(zhǎng)階段的旋鏈角毛藻濾液條件下，中肋骨條藻的生長(zhǎng)曲線。添加濾液的兩實(shí)驗(yàn)組中，中肋骨條藻進(jìn)入指數(shù)期的時(shí)間比海水對(duì)照組晚，旋鏈角毛藻的指數(shù)期和衰亡期濾液對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)均顯示了抑制作用，兩實(shí)驗(yàn)組的最大抑制率均出現(xiàn)在第60 h，分別為82%和68%。同時(shí)，44 h后兩組中肋骨條藻藻密度之間有顯著性差異（p＜0.05），表明指數(shù)期濾液抑制效果強(qiáng)于衰亡期。Fv／Fm的結(jié)果（未給出）顯示，前70 h，在旋鏈角毛藻指數(shù)期濾液中培養(yǎng)的中肋骨條藻Fv／Fm值小于衰亡期濾液中的Fv／Fm值，且實(shí)驗(yàn)組Fv／Fm值顯著小于海水對(duì)照組，說(shuō)明中肋骨條藻在旋鏈角毛藻濾液中的生長(zhǎng)受到脅迫，這種作用指數(shù)期濾液比衰亡期強(qiáng)。結(jié)合中肋骨條藻生長(zhǎng)過(guò)程中的藻密度與Fv／Fm值結(jié)果，可以得出旋鏈角毛藻指數(shù)期及衰亡期濾液對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，且指數(shù)期濾液的化感作用強(qiáng)于衰亡期濾液。

3.3 光和細(xì)菌對(duì)旋鏈角毛藻化感作用的影響

按實(shí)驗(yàn)方法2.1對(duì)中肋骨條藻進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，包括海水每天添加抗生素放置20 d組、濾液每天添加抗生素放置20 d組、濾液避光放置20 d組、新鮮濾液組及海水空白對(duì)照組，得到中肋骨條藻生長(zhǎng)曲線（見(jiàn)圖4）。濾液中添加抗生素，可排除細(xì)菌對(duì)化感物質(zhì)的影響，避光放置排除了光對(duì)化感物質(zhì)的影響。從圖4可以看出，海水添加抗生素組與海水空白對(duì)照組中培養(yǎng)的中肋骨條藻，藻密度沒(méi)有差異（p=0.98），F(xiàn)v／Fm值（結(jié)果未列出）差異也不大（p=0.76），說(shuō)明每天添加0.5 mg／L的鏈霉素與多黏菌素B，不影響中肋骨條藻的生長(zhǎng)。而濾液添加抗生素組、濾液避光放置組、新鮮濾液組與對(duì)照組相比，均抑制中肋骨條藻的生長(zhǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中的平均抑制率分別為30%、13%、57%，即抑制效果為新鮮濾液強(qiáng)于濾液添加抗生素組強(qiáng)于濾液避光放置組。Fv／Fm值結(jié)果表明，中肋骨條藻在旋鏈角毛藻新鮮濾液中受到的生長(zhǎng)脅迫作用最明顯，其次是在添加抗生素的旋鏈角毛濾液中。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)20 d的放置，旋鏈角毛藻濾液中的化感物質(zhì)發(fā)生了降解，降解方式包括光降解和細(xì)菌降解兩種，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，細(xì)菌降解強(qiáng)于光降解。

圖3 中肋骨條藻在旋鏈角毛藻不同生長(zhǎng)時(shí)期濾液中的生長(zhǎng)曲線

圖4 中肋骨條藻在不同放置方法的旋鏈角毛藻濾液中的生長(zhǎng)曲線

3.4 濾液中化感物質(zhì)萃取

為了完成化感物質(zhì)的萃取，首先要研究有機(jī)試劑對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的影響。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了添加體積分?jǐn)?shù)為1%的DMSO、乙醚、乙酸乙酯、正已烷的培養(yǎng)基對(duì)中肋骨條藻的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（未列出）顯示，除添加1%DMSO的實(shí)驗(yàn)組與海水對(duì)照組中肋骨條藻藻密度沒(méi)有顯著差異外，乙醚、乙酸乙酯、正已烷對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)都有抑制作用。因此，在后續(xù)的提取實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除萃取劑，再用0.5%DMSO溶解萃取物，并添加至f／2培養(yǎng)基中用于培養(yǎng)中肋骨條藻，得到的生長(zhǎng)曲線如圖5所示。從圖中可以看出，不同極性的有機(jī)萃取物對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)都顯示了抑制作用，相同萃取條件下，抑制作用由強(qiáng)到弱的順序?yàn)橐宜嵋阴?、正已烷、乙醚，三者平均抑制率?5%、48%、16%。此結(jié)果說(shuō)明旋鏈角毛藻濾液中對(duì)中肋骨條藻起作用的化感物質(zhì)較易溶于乙酸乙酯。

圖5 中肋骨條藻在添加不同濾液萃取物的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

3.5 乙酸乙酯萃取物的光譜掃描

已知旋鏈角毛藻濾液的乙酸乙酯萃取物對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)影響最大，為得到旋鏈角毛藻化感物質(zhì)的初步結(jié)構(gòu)，對(duì)乙酸乙酯萃取物進(jìn)行了紫外-可見(jiàn)光區(qū)吸光度的全光譜掃描，由結(jié)果可知，旋鏈角毛藻濾液的乙酸乙酯萃取物在255～260 nm處有最大吸收峰，該吸收峰可能為苯環(huán)的吸收峰。以人工海水作參比，在258 nm分別測(cè)定得到海水、旋鏈角毛藻指數(shù)期濾液的吸光度（表2），結(jié)果表明，與海水相比，旋鏈角毛藻濾液中增加了在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)有吸收峰的物質(zhì)，可能是旋鏈角毛藻的化感物質(zhì)。

表2 旋鏈角毛藻指數(shù)期濾液的吸光度

4 討論

化感物質(zhì)是研究化感作用的關(guān)鍵，也是化感作用這個(gè)生態(tài)學(xué)現(xiàn)象向?qū)嶋H應(yīng)用領(lǐng)域轉(zhuǎn)化的橋梁，除驗(yàn)證和描述化感現(xiàn)象外，更應(yīng)關(guān)注化感物質(zhì)的研究。在已知旋鏈角毛藻對(duì)中肋骨條藻具有化感作用的前提下，在鑒定化感物質(zhì)的確切結(jié)構(gòu)之前，需探究旋鏈角毛藻化感物質(zhì)的性質(zhì)、穩(wěn)定存在的條件及初步結(jié)構(gòu)，這就是本實(shí)驗(yàn)討論的問(wèn)題。

為達(dá)到富集效果，加熱蒸發(fā)溶劑是常用的方法，即需要確定化感物質(zhì)穩(wěn)定存在的溫度范圍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，旋鏈角毛藻化感物質(zhì)在50℃以?xún)?nèi)是穩(wěn)定的。此外，通常發(fā)現(xiàn)化感物質(zhì)產(chǎn)生的時(shí)期是指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，且浮游植物在不同生長(zhǎng)時(shí)期產(chǎn)生釋放的胞外物質(zhì)成分與含量不同，化感作用效果也就有所差別。例如，穩(wěn)定期塔瑪亞歷山大藻濾液對(duì)東海原甲藻的抑制作用明顯強(qiáng)于指數(shù)期［10］。王江濤等［5］發(fā)現(xiàn)中肋骨條藻指數(shù)期濾液比衰亡期濾液對(duì)其本身具有更強(qiáng)的化感抑制作用。本文選取旋鏈角毛藻不同時(shí)期、藻密度相同的濾液培養(yǎng)中肋骨條藻，排除藻密度差異的影響，結(jié)果顯示旋鏈角毛藻指數(shù)期濾液化感作用強(qiáng)于衰亡期，即旋鏈角毛藻在指數(shù)期分泌更多的化感物質(zhì)。Mykestad實(shí)驗(yàn)表明［11］，指數(shù)期主要積累的胞外產(chǎn)物為蛋白質(zhì)，而多糖主要在N、P限制的穩(wěn)定期產(chǎn)生。結(jié)合以上推測(cè)，旋鏈角毛藻化感物質(zhì)可能為分解溫度在50℃以下的含氮化合物。

溶解有機(jī)物的降解途徑主要包括光降解和生物降解，二者為競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系［12］。其中生物降解主要由細(xì)菌造成，而細(xì)菌與化感作用的關(guān)系，一直以來(lái)都存在爭(zhēng)論。Uronen等［13］認(rèn)為，小三毛金藻Prymnesium parvum的化感作用使鹽水隱藻Rhodomonas salina分泌的DOC增多，引起細(xì)菌量增加，這一過(guò)程通過(guò)微食物環(huán)促進(jìn)了碳的轉(zhuǎn)換，另外小三毛金藻可能直接吞噬細(xì)菌，使其在營(yíng)養(yǎng)鹽限制條件下獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。但也有實(shí)驗(yàn)證明，化感作用效果并不受細(xì)菌影響。Tillmann等［14］用抗生素盤(pán)尼西林、鏈霉素處理塔瑪亞歷山大藻濾液，結(jié)果證明，未經(jīng)抗生素處理的濾液并沒(méi)有表現(xiàn)出化感作用的減弱。另外，Weissbach等［15］研究發(fā)現(xiàn)具有化感作用的塔瑪亞歷山大藻濾液使細(xì)菌生長(zhǎng)加快，但對(duì)細(xì)菌生產(chǎn)力沒(méi)有影響。本文中分別對(duì)濾液進(jìn)行了暗處放置與除菌處理，與新鮮濾液相對(duì)照，以研究旋鏈角毛藻化感物質(zhì)的降解特性及細(xì)菌在旋鏈角毛藻化感效應(yīng)中的作用。已有實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)結(jié)果表明，0.5 mg／L的鏈霉素和多粘菌素B聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)影響很小，且抑菌效果較理想［16］，本實(shí)驗(yàn)中以此方法去除濾液中的細(xì)菌，結(jié)果海水添加抗生素組與海水空白對(duì)照組中培養(yǎng)的中肋骨條藻密度沒(méi)有差異，也證明這兩種抗生素的添加不會(huì)對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。同時(shí)，放置20 d濾液與新鮮濾液培養(yǎng)中肋骨條藻的結(jié)果對(duì)比顯示，新鮮濾液抑制作用強(qiáng)于濾液添加抗生素組強(qiáng)于濾液避光放置組，說(shuō)明光化學(xué)過(guò)程和細(xì)菌降解過(guò)程都會(huì)造成旋鏈角毛藻化感物質(zhì)的降解，且與光化學(xué)過(guò)程相比，細(xì)菌降解更能減弱化感作用。Obernosterer等認(rèn)為光化學(xué)礦化過(guò)程可去除的陸生與水體（含浮游生物）DOC分別為46%與7%，而生物過(guò)程能去除27%陸生和74%浮游生物DOC［17］，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。因此，在旋鏈角毛藻對(duì)中肋骨條藻的化感作用過(guò)程中，細(xì)菌降解與光化學(xué)過(guò)程均引起化感作用的減弱，且二者相比，濾液中細(xì)菌的存在能夠降解更多的化感物質(zhì)。

為了獲得具有明顯化感活性的旋鏈角毛藻代謝產(chǎn)物的粗提物，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了不同極性的有機(jī)物對(duì)旋鏈角毛藻濾液的萃取及各粗提物的化感效應(yīng)檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，相同萃取條件下，具有化感作用的順序從大到小為乙酸乙酯萃取物、正已烷萃取物、乙醚萃取物。丁慧等［18］指出孔石莼提取物對(duì)卵形藻Cocconeis sp.生長(zhǎng)影響程度由高到低依次為：乙酸乙酯提取物、乙醇提取物、石油醚提取物、蒸餾水提取物。極性不同的有機(jī)溶劑提取的蘆竹化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻的抑藻作用出現(xiàn)次序由早到晚依次為甲醇提取物、乙酸乙酯提取物、正己烷提取物。此外，乙酸乙酯粗提強(qiáng)壯前溝藻、海洋原甲藻、錐狀斯氏藻和長(zhǎng)滸苔胞外濾液中的化感物質(zhì)，都具有抑藻活性［19－20］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)旋鏈角毛藻濾液中的化感物質(zhì)較溶于乙酸乙酯，乙酸乙酯萃取物對(duì)中肋骨條藻具有明顯的抑制活性，該結(jié)果是進(jìn)一步分離純化旋鏈角毛藻化感物質(zhì)的基礎(chǔ)。

紫外光譜是測(cè)定有機(jī)分子結(jié)構(gòu)的方法之一，通常掃描的是共軛結(jié)構(gòu)的吸收峰［21］。孫穎穎等［22］研究發(fā)現(xiàn)球等鞭金藻培養(yǎng)液的乙酸乙酯萃取物具有明顯的抑制活性，且抑制物的特征吸收波長(zhǎng)為235 nm。本文中旋鏈角毛藻濾液的乙酸乙酯萃取物在255～260 nm處有最大吸收峰，推測(cè)該吸收峰可能為苯環(huán)的吸收峰，表明旋鏈角毛藻化感物質(zhì)可能為苯衍生物。類(lèi)似的苯衍生物為化感物質(zhì)的結(jié)果有，金魚(yú)藻和苦草中的鄰苯二甲酸酯，鄰苯三酚，對(duì)羥基苯基丙烯酸和4-羥基-3-甲氧基苯甲酸，均抑制銅綠微囊藻的生長(zhǎng)［23－24］。另外，對(duì)羥基苯甲酸對(duì)小球藻有明顯的抑制作用［25］。

5 結(jié)論

在已知旋鏈角毛藻對(duì)中肋骨條藻具有化感作用的前提下，本文研究了旋鏈角毛藻化感作用的影響因素，如溫度、生長(zhǎng)時(shí)期、光照、細(xì)菌等，進(jìn)行了旋鏈角毛藻濾液化感物質(zhì)的萃取和化感效應(yīng)檢驗(yàn)，并推測(cè)了化感物質(zhì)的性質(zhì)和初步結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：旋鏈角毛藻的化感物質(zhì)在50℃以下保持穩(wěn)定；旋鏈角毛藻指數(shù)期濾液化感作用強(qiáng)于衰亡期，表明旋鏈角毛藻指數(shù)期產(chǎn)生并釋放更多化感物質(zhì)；光和細(xì)菌均引起旋鏈角毛藻化感物質(zhì)的降解，且二者相比，細(xì)菌能夠降解更多的化感物質(zhì)；旋鏈角毛藻的乙酸乙酯萃取物具有明顯的化感活性，且該萃取物在255～260 nm處有最大吸收峰。綜合以上結(jié)果，推測(cè)旋鏈角毛藻化感物質(zhì)可能為分解溫度在50℃以上的易被光和細(xì)菌降解的含氮苯衍生物，從極性上看較易溶于乙酸乙酯。下一步分離鑒定旋鏈角毛藻化感物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，可借鑒這些結(jié)論，選擇適當(dāng)?shù)母患椒ǎ瑢?duì)旋鏈角毛藻化感物質(zhì)進(jìn)行純化，并結(jié)合對(duì)中肋骨條藻的化感效應(yīng)檢驗(yàn)，應(yīng)用核磁、質(zhì)譜等技術(shù)對(duì)有效的化感物質(zhì)成分進(jìn)行鑒定。

［1］International Allelopathy Society 1996.Constitution.Drawn up during First World Congress on Allelopathy：A Science for the Future.Cadiz，Spain，1996.Available at：http：／／www.ias.uca.es／bylaws.htm＃CONST1.

［2］Gross E M.Allelopathy of aquatic autotrphs［J］.Critical Reviews in Plant Sciences.2003，22：313－339.

［3］Granéli E，Weberg M，Paulo S.Harmful algal blooms of allelopathic microalgal species：The role of eutrophication［J］.Harmful Algae.2008，8：94－102.

［4］Liu JS，Vanrijssel M，Yang W D，et al.Negativeeffects of Phaeocystis globosa on microalgae［J］.Chinese Journal of Oceanology and Limnology.2010，28（4）：911－916.

［5］Yamasaki Y，Ohmichi Y，Shikata T，et al.Species-specific allelopathic effects of the diatom Skeletonema costatum［J］.Thalassas，2010，27：21－32.

［6］王江濤，李慧，曹婧，等.化感作用對(duì)中肋骨條藻與東海原甲藻競(jìng)爭(zhēng)演替的影響［J］.海洋學(xué)報(bào)，2012，34（1）：1－9.

［7］張議文，王江濤.旋鏈角毛藻和中肋骨條藻間的他感作用［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2012，31（4）：474－478.

［8］祝陳堅(jiān)，韓秀榮，譚麗菊，等.海水分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.青島：中國(guó)海洋大學(xué)出版社，2006，40－63.

［9］Lu H M，Liao X J，Yang Y F，et al.Effects of Extracts from Gracilaria lemaneiform on Microalgae［J］.Ecological Science，2008，27（5）：424－426.

［10］梅長(zhǎng)林，范金城.數(shù)據(jù)分析方法［M］.北京：高等教育出版社，2006（2）：83－85.

［11］Wang Y，Yu Z M，Song X X，et al.Interactions between the bloom-forming dinoflagellates Prorocentrum donghaiense and Alexandrium tamarense in laboratory cultures［J］.JS Res，2006，56：17－26.

［12］Mykestad S.Release of extracellular products by phytoplankton with special emphasis on polysaccharides［J］.The Science of the Total Environment，1995，165：155－164.

［13］Moran M，Sheldon W.Carbon loss and optical property changes during long-term photochemical andbiological degradation of estuarine dissolved organic matter［J］.Limnol Oceanogr，2000，45（6）：1254－1264.

［14］Uronen P，Kuuppo P，Legrand C，et al.Allelopathic effects of toxic haptophyte Prymnesium parvum lead to release of dissolved organic carbon and increase in bacterial biomass［J］.Microbial Ecology，2007，54：183－193.

［15］Tillmann U，Alpermann T，John U，et al.Allelochemical interactions and short-term effects of the dinoflagellate Alexandrium on selected photoautotrophic and heterotrophic protists［J］.Harmful Algae，2008，7：52－64.

［16］Weissbach A，Rudstrom M，Olofsson M，et al.Phytoplankton allelochemical interactions change microbial food web dynamics［J］.Limnol Oceanogr，2011，56（3）：899－909.

［17］王江濤，尹曉楠，宋茜.幾種抗生素的抑菌效果及其對(duì)中肋骨條藻生長(zhǎng)的影響［J］.中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，38（3）：468－472.

［18］Obernosterer I，Benner R.Competition between biological and photochemical processesin the mineralization of dissolved organic carbon［J］.Limnol Oceanogr，2004，49（1）：117－124.

［19］丁慧，藺存國(guó)，鄭紀(jì)勇，等.孔石莼提取物對(duì)海洋硅藻生長(zhǎng)的影響［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2009，28（6）：620－622.

［20］冀曉青.幾株典型赤潮藻化感作用及化感物質(zhì)研究［D］.青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2010.

［21］別聰聰，李鋒民，李媛媛.六種大型藻浸提液對(duì)中肋骨條藻的抑制及活性成分分離［J］.中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，41（7）：107－112.

［22］邢其毅，裴偉偉，徐瑞秋，等.基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2005：156－168.

［23］孫穎穎，王長(zhǎng)海，陳靜.球等鞭金藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制物的分離純化［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2008，28（2）：430－435.

［24］鮮啟鳴，陳海東，鄒惠仙，等.沉水植物中揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻的化感作用［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（11）：3549－3554.

［25］Zhang T，Zheng C，Hu W，et al.The allelopathy and allelopathic mechanism of phenolic acids on toxic Microcystisaeruginosa［J］.J Appl Phycol，2010，22：71－77.

［26］鄭春艷，張哲，胡威，等.三種化感物質(zhì)對(duì)水華混合藻類(lèi)以及多刺裸腹蚤的毒性作用［J］.中國(guó)環(huán)境科，2010，30（5）：710－715.

The study on the influencing factors of Chaetoceros curvisetus allelopathic effect on Skeletonema costatum and the primary research on the properties of Chaetoceros curvisetus allelochemical

Zhang Yiwen1，Wang Jiangtao1，Tan Liju1

（1.Key Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology，Ministry of Education，Ocean University of China，Qingdao 266100，China）

On the basis of the fact that Chaetoceros curvisetus showed allelopathic effect on Skeletonema costatum，a series of experiments，including algal cultures and compounds extraction，were carried out to research the properties，influence factors，degradation characteristics and structure of C.curvisetus allelochemical.The results indicated that allelopathic effect of C.curvisetus was related to the growth phase，and the C.curvisetus filtrates in exponential phase caused the inhibition on the growth of S.costatum than that of declining phase filtrates.Chaetoceros curvisetus allelochemical remain stable under 50℃temperature and degraded as time went on attributed on light and bacteria，and bacteria contributed more.Furthermore，the ethyl acetate extraction of C.curvisetus filtrate showed significant allelopathic effect and the wavelength of characteristic absorption for the growth inhibitor was 255－260 nm.Consequently，the effect ingredient was dissolved by ethyl acetate.In addition，the allelochemical of C.curvisetus was supported to be benzene derivatives whose decomposition temperature was more than 50℃and could be degraded by light and bacteria.

allelochemical；Chaetoceros curvisetus；Skeletonema costatum

Q178.53

A

0253-4193（2014）02-0123-07

2012-09-06；

2013-10-08。

國(guó)家自然科學(xué)基金（41076065）；“973”項(xiàng)目（2010CB428701）。

張議文（1987—），女，山東省威海市人，博士研究生，主要研究方向?yàn)楹Ｑ笊鷳B(tài)化學(xué)。E-mail：shmilyxiaoxi＠163.com *通信作者：王江濤（1967—），男，河北省承德市人，教授，主要研究方向?yàn)楹Ｑ笊鷳B(tài)化學(xué)。E-mail：jtwang＠ouc.edu.cn

張議文，王江濤，譚麗菊.旋鏈角毛藻對(duì)中肋骨條藻化感作用的影響因素及化感物質(zhì)性質(zhì)初探［J］.海洋學(xué)報(bào)，2014，36（2）：123—129，

10.3969／j.issn.0253-4193.2014.02.014

Zhang Yiwen，Wang Jiangtao，Tan Liju.The study on the influencing factors of Chaetoceroscurvisetus allelopathic effect on Skeletonema costatum and the primary research on the properties of Chaetoceros curvisetus allelochemical［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（2）：123—129，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.02.014