明紅霞，樊景鳳＊，梁玉波，關(guān)道明

（1.國家海洋局 國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，遼寧 大連116023）

1 引言

海洋作為生活污水的重要蓄積地為胃腸道病毒（enteric viruses）提供了天然的棲息場所，隨著沿海城市人口的增長，浴場海水和海產(chǎn)品的病毒污染已日益受到關(guān)注，因娛樂用水和貝類引發(fā)的病毒性急性胃腸炎報道在國內(nèi)外屢見不鮮［1］，如1988年上海暴發(fā)的一起因食用毛蚶而造成的大范圍甲肝病毒事件，造成了31萬人感染［2］。

人類腸道腺病毒（Ad V40／Ad V41），屬于腺病毒F亞屬，是全球急性胃腸炎疾病中最流行的病原體之一，全年均可發(fā)生，且無季節(jié)差異［3］。由于腺病毒的核酸為雙股DNA，因此，在自然水體中比RNA胃腸道病毒對紫外線的抵抗能力強［4］。正因如此，其陽性檢出率和含量比其他胃腸道病毒要高一些，在有些環(huán)境樣品中甚至比諾如病毒還高［5］，尤其是當(dāng)常規(guī)細(xì)菌學(xué)指標(biāo)低于管理標(biāo)準(zhǔn)時，該病毒仍然能被檢測出來［6］。此外，腺病毒在環(huán)境樣品中與甲肝病毒、戊肝病毒、人類特異性噬菌體Bactericidesf ragilityHSP40的污染均相關(guān)［7］。因此，美國環(huán)保局已經(jīng)提出將其作為病毒污染的候選指示物，以此來執(zhí)行常規(guī)的水質(zhì)監(jiān)測［8］，同時越來越多的研究證明，腺病毒也可以作為貝類體內(nèi)病毒污染的指示物［9］。

由于腺病毒40和41在細(xì)胞培養(yǎng)過程中很難觀測到噬斑，因此，細(xì)胞培養(yǎng)方法不適合于該病毒的檢測［10］。分子生物學(xué)方法，如PCR技術(shù)以其特異性和敏感性等優(yōu)勢，在海水和貝類等環(huán)境樣品人類胃腸道病毒的檢測中得到廣泛應(yīng)用。本研究以全國主要海水浴場表層海水和沿海省市主要增養(yǎng)殖區(qū)經(jīng)濟貝類為研究對象，以腺病毒為胃腸道病毒指示物，選用實時定量PCR（real－time PCR）技術(shù)對其污染進(jìn)行定量檢測，旨在反映人類胃腸道病毒在這兩種主要傳播介質(zhì)中的污染現(xiàn)狀，同時為近岸海域生態(tài)管理提供科學(xué)依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 樣品的采集

于2007年8月游泳高峰期，選取全國重點沿海省市10個有代表性的海水浴場，從北至南依次是河北北戴河老虎石浴場（BDH）、大連金石灘浴場（JST）、山東煙臺金石灘浴場（YT）、青島第一海水浴場（QD）、江蘇連云港連島浴場（LYG）、浙江寧波松蘭山浴場（NB）、福建廈門黃厝浴場（XM）、廣東深圳大小梅沙浴場（SZ）、廣西北海銀灘浴場（BH）和海南三亞亞龍灣浴場（SY）（圖1a），分別在距岸邊100 m和1 000 m處采集10 L表層海水。

選取海水浴場布站的9個省份和天津市（無海水浴場）10個省市的主要海水貝類增養(yǎng)殖區(qū)，共布設(shè)45個站位，采集162份經(jīng)濟貝類樣品，其中包括蚶類［毛蚶（Scapharcasubcrenata）、泥蚶（Arcagranosa）等］，蛤蜊類［中國蛤蜊（Mactrachinensis）、四角蛤蜊（Mactraquadrangularis）、青蛤（Cyclinasinensis）、菲律賓蛤仔（Ruditapesphilippinarum）等］，蟶類［縊蟶（Sinonovaculaconstricta）、長竹蟶（Solenstrictus）等］，牡蠣類［近江牡蠣（Cr assostrearivul aris）、緣齒牡蠣（Dendostreacrenulif era）、太 平 洋 牡 蠣 （Crassostrea gigas）等］，貽貝類［翡翠貽貝（Per naviridis）、紫貽貝（Mytilusedulis）］和扇貝類［櫛孔扇貝（ChlamysFarreri）、蝦夷盤扇貝（Patinopectenyessoensis）、海灣扇貝（Ar gopectenirradians）等］。冷藏空運回實驗室，凍存?zhèn)錂z，站位布設(shè)如圖1b所示。

2.2 病毒的回收

由于海水和貝類樣品中的病毒含量比較低，所以在進(jìn)行定量檢測之前必須先對其進(jìn)行濃縮回收。

圖1 我國重點海水浴場（a）及貝類增養(yǎng)殖區(qū)（b）調(diào)查站位

水樣中病毒的回收采用超濾法：10 L海水先經(jīng)濾紙過濾除雜質(zhì)，再分別經(jīng)孔徑為0.8μm和0.2μm的濾膜過濾，用Millipore裝置（Millipore Pellicon Mini TFF，截留相對分子質(zhì)量為100×103）將10 L海水濃縮到100 mL左右后用Centricon Plus－70超濾管將水樣濃縮到350μL左右，凍存?zhèn)錂z［11］。

貝類樣品中病毒的回收方法：首先用勻漿器把貝類組織攪碎，取20 g加入等體積的甘氨酸緩沖液（p H 9.0），調(diào)整p H至7.2，震蕩30 min；于4℃5 000 g離心15 min，取上清；4℃10 000 g離心1 h，取上清；4℃140 000 g超速離心1.5 h，取沉淀，用1 mL的磷酸鹽緩沖液（PBS）（p H 7.4）重懸，以沉淀溶解為宜。為去除貝類組織中蛋白質(zhì)對后續(xù)反應(yīng)的影響，向懸液中加入等體積氯仿，震蕩15 min，然后4 000 g離心30 min，收集上層液相即為病毒抽提樣，約500μL。

2.3 Taq Man探針法real－time PCR技術(shù)檢測貝類樣品中的腺病毒

2.3.1 核酸提取

用Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ（Gene Aid）進(jìn)行水樣和貝類樣品中病毒DNA的提取，操作程序按照說明書進(jìn)行，最后溶解于50μL DNA－free水中，待檢。

2.3.2 引物設(shè)計

以腺病毒Ad V40為標(biāo)準(zhǔn)病毒株，根據(jù)其六鄰體（hexon，形成病毒衣殼20個體面的主要蛋白）設(shè)計外引物Ad1和Ad2［11］，構(gòu)建質(zhì)粒，同樣根據(jù)六鄰體區(qū)設(shè)計內(nèi)引物 AD3和 AD4，探針 ADP［12］，建立real－time PCR方法。引物和探針由寶生物工程（大連）有限公司合成，具體信息如表1所示。

表1 腺病毒real－time PCR的引物和探針信息

2.3.3 腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

以Ad V40為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建質(zhì)粒：首先采用外引物Ad1和Ad2進(jìn)行PCR擴增，切下瓊脂糖凝膠中的目的條帶，用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到482 bp的DNA片段。然后用p MD○R 19－T載體將純化后的片段連接到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞上，經(jīng)轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選后，用載體引物（RV－M和 M13－47）擴增驗證目的片段，采用高純度質(zhì)粒提取試劑盒（天根）提取質(zhì)粒，測定吸光度值，計算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

2.3.4 Taq Man探針法real－time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用EASY－Dillution將已知拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒作10倍系列梯度稀釋，將標(biāo)準(zhǔn)DNA稀釋至終濃度為107～100copies／μL，建立探針法real－time PCR。根據(jù)每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值）最小而熒光增加值（ΔRn）較大的原則，確定最佳引物濃度為0.2μmol／L，探針濃度為0.15 μmol／L。反應(yīng)體系為20μL：PremixExTaqTM（2×）10.0μL；PCR上游引物AD3（10μmol／L）0.4μL；下游引物 AD4（10μmol／L）0.4μL；熒光探針 ADP（3 μmol／L）1.0μL；ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL；DNA模板1.0μL；dd H2O（滅菌雙蒸水）6.8μL，每個樣品設(shè)置兩個平行。優(yōu)化后的反應(yīng)程序采用三步法：95℃10 s；58℃15 s；62℃1 min，40 cycles。利用實時定量PCR儀（7500 ABI公司）SDS軟件獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相應(yīng)數(shù)據(jù)。

2.3.5 Real－time PCR靈敏度、特異性和重復(fù)性測試

為檢測Taq Man探針法real－time PCR方法的靈敏度，將質(zhì)粒逐級稀釋，檢測其靈敏度。

為檢測Taq Man探針法real－time PCR引物和探針的特異性，在操作過程中用上述引物和探針同時進(jìn)行脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型疫苗株、甲肝病毒疫苗株、輪狀病毒和星狀病毒的c DNA擴增，用磷酸鹽緩沖液（PBS）作為陰性對照。

為檢測Taq Man探針法real－time PCR的重復(fù)性，分兩次重復(fù)檢測同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)品106copies／μL，即每次實驗均用此標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，各設(shè)6個平行，比較兩次結(jié)果Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3.6 樣品中腺病毒的定量測定

通過預(yù)實驗測定樣品的濃度范圍，從而確定標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋范圍。取海水和貝類樣品的DNA為模板，采用已建立的探針法real－time PCR定量檢測20份表層海水和162份貝類樣品中的腺病毒。每個樣品設(shè)置兩個重復(fù)，實驗同時設(shè)置陰性對照，擴增標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

應(yīng)用Fisher exact test軟件，分析腺病毒的污染在離岸100 m和1 000 m處是否有差別，取95%的置信區(qū)間。

3 結(jié)果

3.1 Taq Man探針法real－time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

以起始模板數(shù)（CO）的對數(shù)為X軸，以臨界循環(huán)數(shù)為Y軸，建立實時定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)擴增，當(dāng)DNA重組質(zhì)粒在5.187×106～5.187×102copies／μL范圍內(nèi)時曲線的相關(guān)性最好，相關(guān)系數(shù)（R2）＝0.996 3，斜率為－3.028（有效范圍－3.0～－3.5），陰性對照無擴增，符合樣品測定的要求（圖2）。

3.2 Real－time PCR方法的靈敏度、特異性和重復(fù)性試驗

經(jīng)測定，本研究建立的real－time PCR方法至少能檢測到51 copies病毒。

以脊髓灰質(zhì)炎病毒、甲肝病毒、輪狀病毒和星狀病毒4種常見胃腸道感染病毒的c DNA為模板，檢測real－time PCR方法的特異性，結(jié)果均無信號擴增，說明引物和探針特異性良好，后續(xù)由該方法測定的腺病毒結(jié)果可靠。

Real－time PCR方法的重復(fù)性測試結(jié)果如表2所示，兩組重復(fù)實驗測得5.187×106copies／μL標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.087和0.082，說明本研究建立的real－time PCR方法重復(fù)性良好。

3.3 樣品中腺病毒的檢測

經(jīng)超濾法濃縮后，采用優(yōu)化的real－time PCR方法檢測全國10個海水浴場表層海水，結(jié)果有5個浴場受到了腺病毒污染，20份水樣中有7份樣品呈腺病毒陽性，陽性檢出率為35%，其濃度范圍為1.1×107～2.8×107copies／L，具體含量如表3所示。應(yīng)用Fisher exact test軟件分析腺病毒的污染與離岸距離的遠(yuǎn)近（100 m和1 000 m）之間相關(guān)性，結(jié)果二者差異不顯著（表4）。

表3 中國近岸20份海水樣品的Taq Man real－time PCR檢測結(jié)果

應(yīng)用優(yōu)化的real－time PCR方法對162份貝類樣品中腺病毒進(jìn)行分析，結(jié)果得到19份陽性樣品，其陽性檢出率為11.7%，貝類組織中腺病毒含量為2.4×104～3.1×105copies／g，與Costafreda等［13］檢測的蛤蜊體內(nèi)甲肝病毒含量（103～105copies／g）相近。全國10個重點沿岸省市除河北省和天津市外，其余8個省份主要增養(yǎng)殖區(qū)的經(jīng)濟貝類均被腺病毒污染。在選取的6種經(jīng)濟貝類樣品中，除蚶類外其余5種均被腺病毒污染，其中牡蠣的陽性檢出率最高（為29.4%），其次是蟶類（為15.8%）（表5）。

表4 離岸100 m和1 000 m距離處海水中腺病毒陽性之間的相關(guān)性分析

表5 全國10個沿海省市162份貝類的腺病毒定量檢測結(jié)果

4 討論

環(huán)境中的腸道腺病毒主要通過糞－口途徑進(jìn)入人體，在海水浴場娛樂（如游泳、劃船等）時接觸了受腺病毒沾污的海水，生食或食用烹調(diào)不當(dāng)?shù)娜静《镜暮．a(chǎn)品，都有可能造成胃腸炎疾病的感染［14］。雖然腺病毒已經(jīng)在環(huán)境樣本中被普遍檢測到［15—16］，但是在我國海水浴場和貝類樣品中的相關(guān)報道并不多見。前期，我們在主要游泳季節(jié)（5—10月），采用普通PCR技術(shù)分析結(jié)果表明，大連星海浴場表層海水中四種胃腸道病毒污染比較普遍，且8月份游泳高峰期最為嚴(yán)重，以腺病毒污染為首［17］。用同樣的方法檢測了8月份我國主要增養(yǎng)殖區(qū)經(jīng)濟貝類，結(jié)果顯示腺病毒的污染也比較普遍［18］。為全面掌握腺病毒的污染程度，本研究在前期定性檢測的基礎(chǔ)上對腺病毒進(jìn)行了定量檢測。

全國10個海水浴場20份水樣中腺病毒的含量為1.1×107～2.8×107copies／L，高于Fong等［18］檢測到的美國某浴場和污水處理廠中腺病毒污染濃度（5.35×105和1.15×106copies／L）。由此可見，目前污水處理方法不足以去除其中的病毒粒子。通過比較娛樂者較密集的離岸100 m處和較稀疏的離岸1 000 m處腺病毒的分布與含量發(fā)現(xiàn)，雖然前者陽性檢出率比后者高（表3），但是二者無顯著差別（見表4）。分析可能是由于潮汐、風(fēng)浪等作用將病毒的污染范圍進(jìn)一步擴大，同時也反映了腺病毒在水環(huán)境中存活的時間較長，這一結(jié)果與指示細(xì)菌的分布有所不同［20］。

有關(guān)貝類體內(nèi)甲肝病毒和諾如病毒的real－time PCR檢測比較多［21—22］，但是腺病毒的相關(guān)報道卻很少，目前僅見Engelska［23］對牡蠣和貽貝體內(nèi)腺病毒35型污染情況進(jìn)行分析。自貝類傳播的微生物疾病被第一次報道以來，全世界因食用貝類而造成的胃腸炎疾病屢見不鮮［24］。在本次受檢的162份貝類樣品中，牡蠣的陽性檢出率最高（表5），這一結(jié)果與國外臨床調(diào)查結(jié)果一致［25］。美國每年有3 300萬例食物傳播疾病，其中8%由生食牡蠣引起，在因食用貝類而造成的胃腸炎疾病案例中牡蠣占了44%［26］。由此可見，牡蠣具有較強的攜帶病毒的能力。牡蠣是我國重要的海產(chǎn)貝類，除了能夠富集甲肝、諾如病毒等病毒外，還能富集副溶血性弧菌等病原菌［27］，此外，還可能同時攜帶幾種不同的病原體［28］，然而我國乃至世界沿海城市素有生食牡蠣的習(xí)慣，在本次調(diào)查中，牡蠣中腺病毒含量達(dá)2.4×104～1.1×105copies／g，由于目前的檢測方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化，導(dǎo)致目前國內(nèi)外食品衛(wèi)生安全中尚未對胃腸道病毒這一重要病原體作出安全閾值規(guī)定［29］，因此，為保障食品安全，消費者在食用雙殼貝類時，一定要充分煮熟；同時建議管理者盡快將胃腸道病毒指標(biāo)檢測規(guī)范化并列入《海水貝類衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》［28］。

在本次調(diào)查的10個沿海省市中，除天津市外其余省份的海水浴場或經(jīng)濟貝類均有不同程度的污染，尤其是山東、遼寧和浙江3個省份，其海水浴場和貝類增養(yǎng)殖區(qū)同時受到了腺病毒的污染，可見這3個省份近岸海水中糞便污染是一個比較普遍的現(xiàn)象。如果游泳者在被污染的海水浴場活動，或消費者食用被污染的貝類，都有可能造成感染。另有報道稱，感染者及其攜帶者的糞便中病毒含量高達(dá)108～1010copies／g［30］，一旦感染者的糞便未經(jīng)適當(dāng)處理排入環(huán)境中，就有可能造成循環(huán)污染。

本研究采用real－time PCR方法，對我國主要海水浴場表層海水和海水增養(yǎng)殖區(qū)經(jīng)濟貝類中腺病毒的污染進(jìn)行了定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腺病毒在這兩個主要傳播介質(zhì)中存在普遍，且污染含量較高。人類腸道腺病毒可以很好地指示糞便污染，可以幫助公眾預(yù)警病毒在人群中的暴發(fā)流行［31］。為管理部門制定娛樂用水以及貝類食品安全標(biāo)準(zhǔn)提供可靠的依據(jù)。

5 結(jié)論

（1）采用 Taq Man 探針法real－time PCR技術(shù)，分析全國10個海水浴場表層海水中腸道腺病毒的污染，其陽性檢出率為35%，污染濃度為1.1×107～2.8×107copies／L；離岸100 m處和1 000 m處腺病毒的污染分布及濃度沒有顯著差異。

（2）采用 Taq Man 探針法real－time PCR技術(shù)，分析全國10個省市162份經(jīng)濟貝類中腺病毒的陽性檢出率為11.7%，污染濃度為2.4×104～3.1×105copies／g，10個省市中有8個省市檢出腸道腺病毒，6種經(jīng)濟貝類中，牡蠣富集病毒的能力最強。

（3）在調(diào)查的10個省市中，山東、遼寧和浙江3省的海水浴場和主要經(jīng)濟貝類均受到了腺病毒的污染，說明這3個省份近岸糞便的污染普遍。人類腸道腺病毒可以很好地指示糞便污染，幫助公眾預(yù)警病毒在人群中的暴發(fā)流行。

致謝：感謝中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制段招軍研究員為本研究提供病毒陽性樣本！

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