王帥，鄭立，韓笑天，李林，楊佰娟，劉晨光

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島 266003；2.國(guó)家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心，山東青島 266061；3.中國(guó)科學(xué)院海洋所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；4.青島科技大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，山東青島 266042）

不同適溫海洋富油微藻在富碳培養(yǎng)條件下的油脂積累特性研究

王帥1，2，鄭立2*，韓笑天3，李林4，楊佰娟2，劉晨光1

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東青島 266003；2.國(guó)家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心，山東青島 266061；3.中國(guó)科學(xué)院海洋所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266071；4.青島科技大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，山東青島 266042）

本實(shí)驗(yàn)分別針對(duì)3株低溫藻株：微擬球藻Nannochloropsissp.ZL-12、四爿藻Tetraselmis chuiZL-33和小球藻Chlorellasp.ZL-45，3株中溫藻株：球等鞭金藻Isochrysis galbanaCCMM5001、等鞭金藻Isochrysissp.CCMM5002和微擬球藻Nannochloropsissp.CCMM7001，3株高溫藻株：微擬球藻Nannochloropsissp.JN1、綠色巴夫藻Pavlova viridisJN2和海洋小球藻Chlorellasp.JN3，研究了在通入0.03%（空氣）、5%、10%3個(gè)CO2濃度梯度條件下的生長(zhǎng)特性，同時(shí)考察了其總酯及中性脂的累積情況。結(jié)果顯示，富碳培養(yǎng)有利于不同溫度條件下9株藻株的生長(zhǎng)，除微擬球藻Nannochloropsissp.CCMM7001最適生長(zhǎng)的CO2濃度為5%外，其余8株藻株最適生長(zhǎng)的CO2濃度均為10%。在低溫和高溫條件下，6株海洋富油微藻在通入10%CO2時(shí)具有最大生物量產(chǎn)率，在中溫條件下球等鞭金藻和等鞭金藻在通入10%CO2時(shí)獲得最大生物量產(chǎn)率，而微擬球藻在通入5%時(shí)獲得最大生物量產(chǎn)率，隨著CO2濃度的增加，9株藻株的總脂含量和中性脂含量有明顯提高。低溫和中溫藻株的總脂含量高于高溫藻株的總脂含量，從中性脂的累積規(guī)律來(lái)看，9株藻株均在平臺(tái)期的累積達(dá)到最大值，GC -MS分析結(jié)果表明，9株微藻適合制備生物柴油的C14～C18系脂肪酸相對(duì)含量在不同CO2條件下基本保持不變，維持在90%左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所研究的藻株作為富油高固碳優(yōu)良藻株，具備用于海洋生物質(zhì)能耦合CO2減排開(kāi)發(fā)的潛力。

海洋富油微藻；富碳培養(yǎng)；中性脂；油脂積累

1 引言

化石能源的應(yīng)用極大地推動(dòng)了社會(huì)的文明和發(fā)展，但隨著其大量的消耗和使用，儲(chǔ)量日益減少，近幾十年來(lái)，大氣CO2濃度（體積百分?jǐn)?shù)）不斷升高，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和氣候變化問(wèn)題，引起廣泛重視。據(jù)CO2信息分析中心（Carbon Dioxide Information Analysis Center）最新監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示［1］，截至2009年全球石化燃料的碳排放量為8.738×109t，2012年大氣CO2全球平均濃度體積分?jǐn)?shù)已經(jīng)達(dá)到392.6×10-6，并以每年增加1.2×10-6的速度上升。各國(guó)已意識(shí)到問(wèn)題的嚴(yán)重性，1997年締約了“京都協(xié)議書(shū)”，使得CO2在全球范圍內(nèi)受到排放限制，如何減排CO2并對(duì)其進(jìn)行資源化利用也成為研究熱點(diǎn)。因此，大力推進(jìn)碳捕捉與封存技術(shù)的開(kāi)發(fā)，發(fā)展可再生能源已成為世界各國(guó)重點(diǎn)關(guān)注的科學(xué)問(wèn)題。

目前，減少CO2排放的方法，按其原理可分為物理、化學(xué)和生物技術(shù)。采用物理方法簡(jiǎn)單但成本極高，如深海注射、陸地埋葬等；化學(xué)方法主要是通過(guò)酶促反應(yīng)、電化學(xué)方法及碳化作用，將碳源轉(zhuǎn)化為可永久儲(chǔ)存的化學(xué)能源，但這一技術(shù)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用成本也很高，并且在處理過(guò)程中能源的消耗及排放的CO2又會(huì)增加環(huán)境新的負(fù)擔(dān)。生物固碳（生物質(zhì)能）技術(shù)主要利用植物的光合作用固定CO2，其中利用大規(guī)模培養(yǎng)微藻固定CO2是一項(xiàng)新興的生物技術(shù)。微藻生長(zhǎng)速度快、固碳效率高、自身合成油脂能力強(qiáng)且易培養(yǎng)；某些微藻還能耐受如低溫、高溫、高CO2等極端條件，最終將無(wú)機(jī)碳轉(zhuǎn)化成生物質(zhì)能，因此開(kāi)發(fā)微藻油脂是解決能源危機(jī)及環(huán)境污染的最佳選擇之一。此外，微藻還可以做工農(nóng)業(yè)原料生產(chǎn)食品添加劑、藥物和保健品等。綜上所述，微藻這一可持續(xù)性海洋資源，在生物固碳領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

利用微藻進(jìn)行CO2捕捉與封存方面的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，特別是對(duì)微藻的CO2耐受性做了廣泛研究，但研究對(duì)象多為淡水藻中的綠藻和藍(lán)藻，其CO2耐受濃度在5%～40%不等［2］。目前，對(duì)海洋微藻的固碳研究不多，主要是針對(duì)中溫藻中的微擬球藻Nannochloropsissp.、海水小球藻Chlorellasp.、鹽生杜氏藻Dunaliella salina、海鏈藻Thalassiosira weissflogiiH1和三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum等［3］進(jìn)行了研究，而對(duì)于不同適溫條件下固碳方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道，特別是中性脂積累特性也少有研究。研究發(fā)現(xiàn)海洋微藻當(dāng)CO2濃度超過(guò)5%時(shí)，其生長(zhǎng)率，生物量積累都會(huì)受到一定的抑制［4］，而現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，電廠的CO2排放濃度在10%左右［5］，所以要利用海洋微藻進(jìn)行碳減排，必須耐受10%的CO2。此外，適合藻類(lèi)培養(yǎng)的溫度一般在20～25℃范圍內(nèi)，冬季和夏季溫度過(guò)低或過(guò)高時(shí)均不利于藻類(lèi)培養(yǎng)，若要進(jìn)行室外全年培養(yǎng)，則要增加能耗調(diào)節(jié)溫度，這樣不僅增加成本，而且很有可能由此產(chǎn)生的CO2比固定封存的CO2還要多。因此從海洋微藻的藻種篩選上著手，獲得適應(yīng)不同溫度條件下的藻種可以很好的解決這一問(wèn)題。

大型工業(yè)廠區(qū)（如發(fā)電廠）是排放含高濃度CO2的主要場(chǎng)所，其廢氣中含有10%左右高濃度的CO2，高等植物在這種條件下不能存活，因此能夠耐受高濃度CO2的微藻具有較大的應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)考察了9株可耐受不同溫度條件的海洋富油微藻的CO2耐受性。通過(guò)對(duì)其耐受不同濃度CO2氣體的實(shí)驗(yàn)研究，考察了9株海洋富油微藻的生長(zhǎng)、油脂積累及其脂肪酸組成和含量的變化，為從海洋富油微藻中篩選生物質(zhì)能耦合CO2減排開(kāi)發(fā)的潛在優(yōu)良藻種提供生物材料，可延長(zhǎng)全年可進(jìn)行微藻培養(yǎng)的時(shí)間。

2 材料與方法

2.1 材料

本研究選用前期篩選的9株海洋富油微藻（粗油脂含量均大于30%）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3株低溫海洋富油微藻：微擬球藻Nannochloropsissp.ZL-12、四爿藻Tetraselmis chuiZL-33和小球藻Chlorellasp.ZL-45由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所提供。3株中溫海洋富油微藻：球等鞭金藻Isochrysis galbanaCCMM5001、等鞭金藻Isochrysissp.CCMM5002、微擬球藻Nannochloropsissp.CCMM7001由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所提供。3株高溫海洋富油微藻：微擬球藻Nannochloropsissp.JN1、綠色巴夫藻Pavlova viridisJN2和海洋小球藻Chlorellasp.JN3由暨南大學(xué)提供。

2.2 實(shí)驗(yàn)

2.2.1 海洋微藻培養(yǎng)

海洋微藻培養(yǎng)采用f／2培養(yǎng)基［6］配方，培養(yǎng)條件為：溫度分別設(shè)定為15℃、25℃、30℃，光照強(qiáng)度100 μmol／（m2·s），光暗周期比12 h∶12 h，通入不同CO2濃度氣體（占空氣的體積比為：0.03%、5%、10%）進(jìn)行培養(yǎng)。用玻璃轉(zhuǎn)子流量計(jì)控制通氣速率，通氣量為0.1 vvm（volume gas per volume media permin），12 h光周期不間斷通氣（其中CO2為每天6 h不間斷通氣）。每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行組。每24 h定時(shí)取藻液進(jìn)行細(xì)胞密度和中性脂測(cè)定。培養(yǎng)至平臺(tái)期收集生物量，測(cè)定每種海洋微藻的總脂及脂肪酸組成。

2.2.2 細(xì)胞密度的計(jì)算和中性脂的測(cè)定

2.2.2.1 細(xì)胞密度和生物量的測(cè)定

每天定時(shí)取藻液樣品，利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞密度的測(cè)定。6 000 r／min離心5 min，收集藻細(xì)胞，冷凍干燥后將藻粉稱(chēng)重即獲得生物量干質(zhì)量，計(jì)算平臺(tái)期生物量平均生長(zhǎng)率。

生物量產(chǎn)率計(jì)算根據(jù)公式：

平均油脂產(chǎn)率計(jì)算則根據(jù)：

式中，P為生長(zhǎng)率，X為時(shí)間d時(shí)的生物量干質(zhì)量，d為時(shí)間，L為平均油脂產(chǎn)率，C為總脂含量［7—8］。

2.2.2.2 中性脂的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)中性脂的測(cè)定采用高通量尼羅紅（J&K Scientific公司）染色法［9—10］。用多功能酶標(biāo)儀（Tecan Infinite M200）測(cè)定單位體積藻液的熒光值（激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為580 nm），通過(guò)單個(gè)藻細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的變化來(lái)表征中性脂積累的變化。

單個(gè)藻細(xì)胞熒光值的計(jì)算公式：

式中，F(xiàn)I為單個(gè)藻細(xì)胞中性脂熒光強(qiáng)度，F(xiàn)NL為尼羅紅染色的熒光總強(qiáng)度，F(xiàn)為不加尼羅紅藻液的熒光強(qiáng)度，Y為細(xì)胞密度［11］。

2.2.3 微藻總脂提取和脂肪酸分析

將微藻培養(yǎng)至平臺(tái)期，用離心機(jī)（CR22GII，日本HITACHI公司）收集藻體（4℃，12 000 r／min），藻體進(jìn)行冷凍干燥，用改進(jìn)的三氯甲烷-甲醇提取法測(cè)定總脂含量［12］?？傊?jīng)皂化和甲酯化處理后，用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)GC-MS（5975 CMSD和7890 GC，安捷倫公司）對(duì)脂肪酸組成進(jìn)行分析。色譜柱型號(hào)為HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）。氣相色譜條件：載氣為氦氣，流速為1 m L／min，進(jìn)樣口溫度280℃，傳輸線溫度為280℃；升溫程序?yàn)椋撼鯗?0℃，保持2 min，以6℃／min升到300℃，保持15 min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL。質(zhì)譜條件：離子源為EI，倍增器電壓1 200 V，離子源溫度為230℃，四級(jí)桿溫度150℃，Scan方式檢測(cè)。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS11.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 不同溫度和CO2濃度對(duì)9株海洋微藻生長(zhǎng)曲線與中性脂動(dòng)態(tài)累積

圖1～3給出了不同溫度和CO2濃度條件對(duì)9株海洋富油微藻的生長(zhǎng)和中性脂積累的影響。當(dāng)溫度過(guò)低（15℃）或過(guò)高（30℃）時(shí)，均會(huì)影響微藻生長(zhǎng)，開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)，中溫富油微藻則在第三天即可進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，而高溫富油微藻在第四天進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，低溫富油微藻則在第五天才進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，并且與中溫（7～11 d）和高溫富油微藻（10 d）相比，低溫富油微藻的生長(zhǎng)周期更長(zhǎng)（13 d）。在不同溫度條件下，屬于同一個(gè)屬的3株微擬球藻的生長(zhǎng)情況具有顯著差異（p＜0.05），在25℃條件下細(xì)胞密度達(dá)到最大值（1.90×108個(gè)／m L），明顯高于低溫和高溫處理組。

如圖1所示，當(dāng)海洋微藻進(jìn)入對(duì)數(shù)期后，細(xì)胞密度隨著CO2濃度的提高而變化顯著（p＜0.05）。3株海洋富油低溫微藻在指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞密度由高到低為Y10%、Y5%和Y空氣，小球藻ZL-45在10%CO2條件下最大細(xì)胞密度為6.53×107個(gè)／mL，并且細(xì)胞密度為3株微藻的最大值，明顯高于通入空氣和5%CO2的4.06×107個(gè)／mL和4.16×107個(gè)／mL。微擬球藻ZL-12和四爿藻ZL-33也有類(lèi)似的生長(zhǎng)情況，在CO2濃度為10%時(shí)，細(xì)胞密度顯著增加（p＜0.05），細(xì)胞密度最高可分別達(dá)到5.68×107個(gè)／m L和3.53×107個(gè)／m L，明顯高于通入空氣和5%CO2的細(xì)胞密度。如圖2所示，球等鞭金藻CCMM5001和等鞭金藻CCMM5002在指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞密度由高到低為Y10%，Y5%和Y空氣，而微擬球藻生長(zhǎng)進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)由快到慢為Y5%，Y空氣和Y10%，球等鞭金藻CCMM5001在CO2濃度為10%條件下最大細(xì)胞密度為5.04×107個(gè)／mL，明顯高于通入空氣和5%CO2的3.60×107個(gè)／mL和4.60×107個(gè)／m L，等鞭金藻CCMM5002在CO2濃度為10%條件下，細(xì)胞密度顯著增加（p＜0.05），最高細(xì)胞密度可達(dá)4.86×107個(gè)／m L，明顯高于通入空氣和5%CO2的3.24×107個(gè)／mL和3.60×107個(gè)／mL。微擬球藻CCMM7001在CO2濃度為5%條件下生長(zhǎng)最快，到達(dá)平臺(tái)期時(shí)，細(xì)胞密度最高可達(dá)1.90×108個(gè)／m L。10%的CO2濃度對(duì)微擬球藻CCMM7001有一定的毒害作用，微擬球藻的生長(zhǎng)受到了抑制，收獲密度僅有7.66×107個(gè)／m L，甚至低于通入空氣的1.76×108個(gè)／mL。如圖3所示，3株海洋富油高溫微藻在指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞密度由高到低為Y10%，Y5%和Y空氣，微擬球藻JN1在10% CO2條件下最大細(xì)胞密度為8.11×107個(gè)／m L，并且細(xì)胞密度為3株微藻的最大值，明顯高于通入空氣和5%CO2的6.20×107個(gè)／m L和6.62×107個(gè)／m L。綠色巴夫藻JN2和海洋小球藻JN3在10%CO2和5%CO2條件下，細(xì)胞密度沒(méi)有顯著差異（p＜0.05），在通入10%CO2條件下，細(xì)胞密度達(dá)到最大值（6.26 ×107個(gè)／m L和6.75×107個(gè)／m L），明顯高于通入空氣和5%CO2的細(xì)胞密度。

圖1 不同CO2濃度條件下3株低溫海洋富油微藻的生長(zhǎng)曲線（a、c和e）和中性脂積累（b、d和f）的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.1 The growth curve（a，c and e）and neutral lipid accumulation（b，d and f）of 3 strains of cold resisting marine microalgae under different CO2concentrations（Mean±SD）

圖2 不同CO2濃度條件下3株中溫海洋富油微藻的生長(zhǎng)曲線（a、c和e）和中性脂積累（b、d和f）的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.2 The growth curve（a，c and e）and neutral lipid accumulation（b，d and f）of 3 strains of mesophilic marine microalgae under different CO2concentrations（Mean±SD）

實(shí)驗(yàn)采用尼羅紅染色法對(duì)海洋微藻細(xì)胞內(nèi)中性脂含量進(jìn)行測(cè)定。如圖1所示，CO2濃度對(duì)9株海洋富油微藻的中性脂動(dòng)態(tài)積累過(guò)程具有顯著影響，單因子方差分析表明，與通入空氣和5%CO2的處理組相比，10%濃度CO2對(duì)9株海洋富油微藻的單個(gè)藻細(xì)胞中性脂熒光強(qiáng)度具有極顯著作用（p＜0.01），單個(gè)藻細(xì)胞中性脂熒光強(qiáng)度隨著CO2濃度增加呈現(xiàn)梯度增加趨勢(shì)：FI10%、FI5%和FI空氣。微藻中性脂含量主要在指數(shù)生長(zhǎng)期后期以及穩(wěn)定期進(jìn)行積累，中性脂含量隨著溫度的降低明顯升高，在低溫條件下（15℃），中性脂含量迅速積累，而在中溫和高溫條件下，總體呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。在不同溫度條件下，屬于同一個(gè)屬的3株微擬球藻的中性脂動(dòng)態(tài)積累情況具有顯著差異（p＜0.05），在15℃條件下單個(gè)藻細(xì)胞中性脂熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，明顯高于中溫和高溫處理組。

3.2 不同溫度和CO2濃度對(duì)微藻生長(zhǎng)率及平均油脂產(chǎn)率的影響

圖3 不同CO2濃度條件下3株高溫海洋富油微藻的生長(zhǎng)曲線（a、c和e）和中性脂積累（b、d和f）的影響（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Fig.3 The growth curve（a，c and e）and neutral lipid accumulation（b，d and f）of 3 strains of heat resisting marine microalgae under different CO2concentrations（Mean±SD）

9株海洋富油微藻的最大生物量產(chǎn)率、總脂含量及平均油脂產(chǎn)率均隨CO2濃度提高而顯著提高（p＜0.05）（見(jiàn)表1），在中溫條件下，富油微藻的最大生物量產(chǎn)率、總脂含量及平均油脂產(chǎn)率達(dá)到最大值。3株海洋富油低溫微藻和3株海洋富油高溫微藻的最大生物量產(chǎn)率、總脂含量及平均油脂產(chǎn)率均在10% CO2條件下達(dá)到最大值，3株海洋富油中溫微藻中，球等鞭金藻CCMM5001和等鞭金藻CCMM5002的最大生物量產(chǎn)率、總脂含量及平均油脂產(chǎn)率均在10%CO2條件下達(dá)到最大值，而微擬球藻CCMM7001的最大生物量產(chǎn)率在5%CO2條件下達(dá)到最大值（122.25±1.17）mg／（L·d），平均油脂產(chǎn)率也達(dá)到最大值（43.41±3.00）%，此時(shí)總脂含量為（36.00±2.12）%。在CO2通氣濃度為10%條件下，由于抑制了微擬球藻藻本身的生長(zhǎng)，最大生物量產(chǎn)率僅有（85.43±8.61）mg／（L·d），但是油脂含量較高，達(dá)到（41.20±1.69）%。

3.3 不同溫度和CO2濃度對(duì)微藻的脂肪酸組成及相對(duì)含量的影響

表2給出了不同溫度和CO2濃度條件對(duì)9株海洋富油微藻的脂肪酸組成和相對(duì)含量的影響。如表2所示，C14、C16、C18和C20是3株海洋富油低溫微藻（微擬球藻ZL-12、四爿藻ZL-33和小球藻ZL-45）和3株海洋富油高溫微藻（微擬球藻JN1、綠色巴夫藻JN2和海洋小球藻JN3）主要的脂肪酸組成部分，而C14、C16、C18是3株海洋富油中溫微藻（球等鞭金藻CCMM5001、等鞭金藻CCMM5002和微擬球藻CCMM7001）主要的脂肪酸組成部分，9株海洋富油微藻在不同CO2濃度條件下，C14～C18占脂肪酸組成80%以上，其中C16含量較高。

表1 9株海洋微藻不同CO2濃度條件下的最大生物量產(chǎn)率，總脂含量及平均油脂產(chǎn)率（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差）Tab.1 The maxium biomass yield，total lipid concentration and average lipid productivity of 9 strains of marine microalgae under different CO2concentrations（Mean±SD）

就不同的脂肪酸組成而言，3株海洋富油低溫微藻的C18含量隨CO2濃度的增加而增加，微擬球藻、四爿藻和小球藻的C18含量分別由10.93%增加至18.49%，6.98%增加至16.00%，10.74%增加至15.99%。此外，3株海洋富油低溫微藻均具有一定含量的二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA）（C22∶6），含量范圍在1.08%～2.86%之間，二十碳五烯酸（Eicosapntemacnioc Acid，EPA）（C20∶5）含量均未檢測(cè)到。3株海洋富油中溫微藻中，微擬球藻CCMM7001的C14含量非常少，僅為3%左右，而其他兩株金藻在20%以上，而微擬球藻C16含量較高，保持在78%以上，而其他兩株金藻則在30%以下。球等鞭金藻和等鞭金藻DHA（C22∶6）含量較高，在5%～10%之間，EPA（C20∶5）含量則較低；而微擬球藻的DHA（C22∶6）沒(méi)有檢測(cè)到，但EPA（C20∶5）含量較高。3株海洋富油高溫微藻中，海洋小球藻JN3的C18含量較高，保持在13%以上，最高達(dá)到17.7%，而其他兩株則保持在7%～10%之間。此外，3株海洋富油高溫微藻中EPA（C20∶5）含量較高，微擬球藻含量達(dá)到最大值5.43%；但DHA（C22∶6）較低，僅在海洋小球藻檢測(cè)到含有DHA，含量范圍在0.34%～0.59%。

從整體來(lái)看，9株海洋富油微藻脂肪酸組分的含量隨CO2濃度的變化而改變，但適合于制備生物柴油的脂肪酸成分C14～C18總量一直維持在較高水平，均保持在80.45%～95.14%之間。3株海洋富油低溫微藻的多不飽和脂肪酸（PUFAs）含量隨CO2濃度的增加而明顯降低，微擬球藻ZL-12、四爿藻ZL-33和小球藻ZL-45的PUFAs含量分別由61.44%降低至50.06%，66.66%降低至59.51%，57.64%降低至48.41%。3株海洋富油中溫微藻中，球等鞭金藻CCMM5001的PUFAs隨CO2濃度的增加，其總量由37.01%增加到了53.78%，最主要的原因是C18∶1從7%增加到了42%，而其他兩株P(guān)UFAs的變化不明顯，保持在45.5%～50%之間。3株海洋富油高溫微藻的PUFAs隨CO2濃度的增加而增加，其總量均在CO2濃度為5%時(shí)達(dá)到最大值。

3 討論

CO2是植物光合作用的底物，又是光合作用的主要限制因子之一。微藻進(jìn)行光合作用，首先由1，5-二磷酸核酮糖羧化酶氧合酶（Rubisco）固定CO2，再通過(guò)卡爾文循環(huán)轉(zhuǎn)化為有機(jī)物［13］。因此，微藻生長(zhǎng)環(huán)境中CO2濃度升高可在兩方面影響其光合作用，一方面增加了CO2對(duì)Rubisco酶結(jié)合位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)，從而提高羧化速率；另一方面通過(guò)抑制光呼吸提高凈光合效率［14］。影響微藻固定CO2的因素很多，主要為CO2濃度和溫度。不同藻種和藻株最適生長(zhǎng)所耐受的CO2濃度各異，大多數(shù)海洋微藻最適CO2濃度不超過(guò)5%，例如微擬球藻Nannochloropsissp.［15］、三角褐指藻Phaeodactylum tricornulum［16］和紫球藻Porphyridiumsp.［17］等的最佳生長(zhǎng)濃度為5%。Yue和Chen［18］從淡水中分離出一株能耐高濃度CO2的小球藻ChlorellaZY-1，CO2濃度為10%的時(shí)候出現(xiàn)最大生長(zhǎng)速率。Yoon等［19］研究了多變魚(yú)腥藻Anabaenavariabilis在不同進(jìn)氣CO2濃度下的生長(zhǎng)情況，CO2濃度為4%～13%時(shí)，沒(méi)有觀察到停滯期，在CO2濃度為18%時(shí)，則出現(xiàn)了停滯期，藻細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，可能是過(guò)高的CO2濃度使培養(yǎng)基p H降低引起的。歐陽(yáng)崢嶸等［20］的研究表明，溫度過(guò)高會(huì)影響海洋微藻的放氧速率，微藻固碳率也會(huì)降低。徐寧等［21］通過(guò)對(duì)錐狀斯氏藻Scrippsiella trochoidea的研究也表明，溫度過(guò)高，微藻固碳能力變?nèi)?。高春燕等?2］分別在15～35℃溫度范圍內(nèi)考察了小球藻對(duì)CO2的脫除效果，在通氣流量為600 mL／min，光強(qiáng)為3 500 lux，CO2入口濃度控制在1%左右條件下，進(jìn)氣中CO2的去除率隨著溫度的升高逐漸增大，在30℃達(dá)到最大值。

本實(shí)驗(yàn)采用尼羅紅染色法測(cè)定了9株海洋富油微藻的中性脂含量，尼羅紅染色后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)油脂含量具有顯著相關(guān)性［10，23—24］。與傳統(tǒng)方法（質(zhì)量法）和色譜法測(cè)定植物中的脂類(lèi)含量［25—26］相比，尼羅紅染色法具有需要樣品量小，處理時(shí)間短，可不經(jīng)抽提，直接測(cè)定藻類(lèi)細(xì)胞的總脂含量等優(yōu)點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，隨著CO2濃度的提高，微藻的中性脂含量明顯增加，且平臺(tái)期為中性脂的積累期，這與王金娜［11］等的研究結(jié)果一致。原因可能是由于藻細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期后，生長(zhǎng)所需蛋白質(zhì)合成量降低，呼吸作用和熱耗散的能量也比指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)有所下降，光合作用所同化的碳主要合成碳水化合物和脂類(lèi)物質(zhì)，表現(xiàn)出能量積累的趨勢(shì)［27—28］，而提高CO2濃度，能為碳水化合物和脂肪的積累提供豐富的碳源。在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中，3株海洋富油中溫微藻和3株海洋富油高溫微藻的中性脂含量呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，而3株海洋富油低溫微藻中性脂含量呈現(xiàn)逐漸積累的趨勢(shì)。原因可能是由于種子液為處于對(duì)數(shù)期后期的微藻，藻細(xì)胞內(nèi)的中性脂含量處于較高水平。在溫度較高條件下，微藻的代謝速度快，同時(shí)在藻體培養(yǎng)前期及指數(shù)生長(zhǎng)過(guò)程中，需要消耗大量的ATP，這部分能量主要由脂類(lèi)提供［29］。本實(shí)驗(yàn)中3株海洋富油中溫微藻和3株海洋富油高溫微藻的中性脂在指數(shù)生長(zhǎng)期消耗增加而使含量降低，因此中性脂含量在指數(shù)生長(zhǎng)期不增加，這與魏東等［30］研究結(jié)果相似，而3株海洋富油低溫微藻可在指數(shù)生長(zhǎng)期緩慢積累中性脂，這可能與其適應(yīng)低溫環(huán)境生長(zhǎng)，通過(guò)適當(dāng)降低生長(zhǎng)速度而增加細(xì)胞內(nèi)油脂含量的儲(chǔ)存，從而達(dá)到保護(hù)自身的作用，目前中性脂的代謝機(jī)制與細(xì)胞生長(zhǎng)周期的關(guān)系尚不明確。

從微藻的脂肪酸組成來(lái)看，3株海洋富油低溫微藻的高不飽和脂肪酸（PUFAs）相對(duì)含量隨著CO2濃度的增加而有所降低，可能的原因是，CO2濃度的增加更促進(jìn)藻類(lèi)對(duì)于中性脂的積累。2株海洋富油中溫微藻（等鞭金藻CCMM5001和微擬球藻CCMM7001）和3株海洋富油高溫微藻的PUFAs相對(duì)含量隨著CO2濃度的增加而增加，等鞭金藻CCMM5002的PUFAs相對(duì)含量隨著CO2濃度的增加變化不大。Tang［8］研究結(jié)果表明，提高CO2濃度有利于斜生柵藻Scenedesmus obliquus和蛋白核小球藻Chlorella pyrenoidosaPUFAs的積累?？赡艿脑蚴?，增加CO2濃度也就是等于相對(duì)降低了通氣中氧氣的濃度，這會(huì)影響去飽和酶的活性［31］，也就使得PUFAs增加。但Tsuzuki等［32］研究也發(fā)現(xiàn)有些藍(lán)綠藻像眼蟲(chóng)屬Euglena和紫球藻屬Porphyridium微藻的PUFAs量也不隨CO2變化而改變，但是具體原因并不確定，對(duì)于利用微藻油脂制備生物柴油而言，不飽和脂肪酸的增加會(huì)影響生物柴油的燃燒性能，因此就不飽和脂肪酸含量而言，3株海洋富油低溫微藻采用濃度為10%的CO2進(jìn)行減排并制備微藻生物柴油綜合效果更好。

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Effect on lipid accumulation of marine oil-rich microalgae under different temperature and CO2enrichment cultivation

Wang Shuai1，2，Zheng Li2，Han Xiaotian3，Li Lin4，Yang Baijuan2，Liu Chenguang1

（1.College of Marine Life Science，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Marine Ecology Research Center，F(xiàn)irst Institute of Oceanography of State Oceanic Administration，Qingdao 266061，China；3.Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science，Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266071，China；4.Qingdao Technology University of Shandong，College of Chemistry and Molecular Engineering，Qingdao 266042，China）

Nine marine microalgae were cultured under different CO2concentrations of ambient air（0.03%），5% and 10%，respectively.Nine marine microalgae include 3 strains of cold resisting marine microalgae（Nannochloropsissp.ZL-12，Tetraselmis chuiZL-33，Chlorellasp.ZL-45），3 strains of mesophilic marine microalgae（Isochrysis galbanaCCMM5001，Isochrysissp.CCMM5002 andNannochloropsissp.CCMM7001）and 3 strains of heat resisting marine microalgae（Nannochloropsissp.JN1，Pavlova viridisJN2 andChlorellasp.JN3）.The growth characterization，accumulation of total and neutral lipid of these microalgae were investigated.The results showed that CO2enrichment cultivation could increase the growth of all nine microalgae，but the optimum CO2concentrations were different.The optimum CO2concentration ofNannochloropsissp.CCMM7001 was 5%，The optimum CO2concentration of 8 strains of marine microalgae was 10%.3 strains of cold resisting marine microalgae and 3 strains of heat resisting marine microalgae reached the maximum biomass yield when culturing with 10%CO2.2 strains of mesophilic marine microalgae（Isochrysis galbanaCCMM5001 andIsochrysissp.CCMM5002）run up to the maximum biomass yield when culturing with 10%CO2.However，the maximum biomass yield ofNannochloropsissp.CCMM7001 was（122.25±1.17）mg／（L·d）when culturing with 5%CO2.With the increased CO2concentration，the total lipid and neutral lipid of three microalgae improved significantly.The total lipid content of 3 strains of cold resisting marine microalgae and 3 strains of mesophilic marine microalgae was higher than 3 heat resisting marine microalgae.The maximum neutral lipid content of 9 strains of microalgae could be accumulated in stationary phase.The fatty acid analysis of 9 strains of microalgae showed the relative content of C14-C18 fattyacid which suitable for biodiesel preparation maintained at 90%when culturing with different CO2concentration. The results indicate our marine oleaginous microalgae with high carbon dioxide fixation ability are the potential excellent strains for marine bioenergy development coupled with CO2emission reduction.

marine oil-rich microalgae；CO2enrichment cultivation；neutral lipid；lipid accumulation

Q946.4

A

0253-4193（2014）12-0041-12

王帥，鄭立，韓笑天，等.不同適溫海洋富油微藻在富碳培養(yǎng)條件下的油脂積累特性研究［J］.海洋學(xué)報(bào)，2014，36（12）：41—52，

10.3969／j.issn.0253-4193.2014.12.004

Wang Shuai，Zheng Li，Han Xiaotian，et al.Effect on lipid accumulation of marine oil-rich microalgae under different temperature and CO2enrichment cultivation［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（12）：41—52，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.12.004

2013-12-13；

2014-02-26。

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金（2012G32，2014 T05）；國(guó)家海洋局青年海洋科學(xué)基金（2012131）；海洋可再生能源專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目“海洋微藻制備生物柴油耦合CO2減排技術(shù)研究與示范”（GHME2001SW02）；山東省科技發(fā)展計(jì)劃“富油微藻的篩選、改造及耦合CO2減排的高密度培養(yǎng)技術(shù)”（2011GHY11533）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“水環(huán)境微生物測(cè)量溯源技術(shù)及計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)研究”（2013BAK12B00）；中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助（KF2012No3）。

王帥（1983—），女，山東省濟(jì)南市人，博士生，助理研究員，主要從事微藻生理生化研究。E-mail：wangshuai＠fio.org.cn

*通信作者：鄭立，博士，副研究員。E-mail：zhengli＠fio.org.cn