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頭孢丙烯片在健康受試者體內(nèi)的生物等效性研究

2014-05-30 00:07王詠梅佟杰曾永箎
中國保健營養(yǎng)·中旬刊 2014年5期
關(guān)鍵詞:異構(gòu)體藥代反式

王詠梅 佟杰 曾永箎

【摘 要】目的:建立人血漿中頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體的高效液相測定法,并評價兩種制劑的人體生物等效性。方法:單劑口服頭孢丙烯片0.5g后,血樣經(jīng)處理后,進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果:頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體的線性范圍為0.1000~16.0000 ?g?mL-1,提取回收率為94.9%~96.0%;頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體的線性范圍為0.0200~1.6000 ?g?mL-1,提取回收率為92.7%~94.1%。人體中受試制劑和參比制劑的頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體的藥代動力學(xué)參數(shù)為:Cmax為(7.93±1.87)和(7.82±1.76)?g?mL-1,Tmax為(1.75±0.67)和(1.81±0.61)h,t1/2為(1.35±0.15)和(1.32±0.16)h ,AUC0-t為(24.56±3.44)和(24.71±3.85) ?g?h?mL-1,;頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體的藥代動力學(xué)參數(shù)為:Cmax為(0.70±0.15)和(0.68±0.16)?g?mL-1,Tmax為(1.72±0.52)和(1.77±0.62)h,t1/2為(1.20±0.28)和(1.24±0.21)h ,AUC0-t為(2.02±0.33)和(2.00±0.44) ?g?h?mL-1。結(jié)論:本方法靈敏、準(zhǔn)確、簡便,適用于臨床藥代動力學(xué)研究;兩制劑生物等效。

【關(guān)鍵詞】頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體;頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體;高效液相色譜法;生物等效性

【中圖分類號】R978.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484(2014)05-2754-02

頭孢丙烯為第二代頭孢菌素類抗生素,具有廣譜抗菌作用[1]。本品的作用機(jī)制是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成,使細(xì)菌迅速破裂溶解。臨床用于治療敏感菌所致的輕、中度感染,包括上呼吸道感染,下呼吸道感染及皮膚和皮膚軟組織感染。頭孢丙烯中順式異構(gòu)體的含量在90 %以上,而反式異構(gòu)體只占10 %以下。順反式異構(gòu)體在化學(xué)穩(wěn)定性和抗GP(革蘭陽性)鏈球菌和葡萄球菌活性方面是相同的,但在抗GN(革蘭陰性)大腸埃希桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血桿菌方面,順式頭孢丙烯的抗菌活性是反式頭孢丙稀的6~8倍。目前國內(nèi)尚無同時測定頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體含量并進(jìn)行生物等效性的報道。本文建立了高效液相色譜同時測定人血漿中頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體濃度的方法,用于頭孢丙烯在人體的藥代動力學(xué)研究。

1材料與方法

1.1 藥品與儀器

受試制劑(A藥):規(guī)格:0.25 g/片,批號:091006,北京賽科藥業(yè)有限責(zé)任公司提供;參比制劑(R藥):商品名:施復(fù)捷?,規(guī)格:0.25 g/片,批號:0905773,中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)。

頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體對照品(含量:92.7 %,批號:H01099);頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體對照品(含量:89.5 %,批號:H05336),均由廠家提供;頭孢拉定對照品(含量:91.8 %,批號:130427-200306),購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇、乙腈均為色譜純,三氯乙酸和二氯甲烷均為分析純;水為純凈水;空白血漿由吉林大學(xué)第一醫(yī)院提供。

LC-10ATvp高效液相色譜儀,配有LC solution Lite工作站(日本島津公司);XW-80A旋渦混合器(上海滬西儀器廠有限公司);TGL-16C高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);AUW120D分析天平(日本島津公司);雷磁pHS-3E pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);KS康式振蕩器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.2 受試對象

18名健康男性志愿者,年齡20~24歲,體重為54~70 kg,體重指數(shù)(BMI)為20~24(BMI=體重(Kg)/身高(m)的平方)。于試驗(yàn)前在醫(yī)院接受全面的體格及化驗(yàn)檢查,結(jié)果血、尿常規(guī),肝、腎功能正常,心電圖正常,均符合受試者入選要求。試驗(yàn)前2周內(nèi)未服用任何藥物。受試者試驗(yàn)前均簽署知情同意書。試驗(yàn)方案經(jīng)吉林大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。臨床試驗(yàn)于吉林大學(xué)第一醫(yī)院進(jìn)行。

1.3 給藥方案與血樣采集

試驗(yàn)采用雙周期自身對照交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。18例受試者隨機(jī)分成2組,每組9人。受試者試驗(yàn)日晨采集空白血樣后,空腹口服受試制劑2片或參比制劑2片以250 mL溫開水送服并做記錄。服藥后2 h可飲水,4 h進(jìn)統(tǒng)一清淡飲食。分別在給藥后的0.25、0.5、0.75、1.0、1.25,1.5、2、2.5、3、4、5、6、8小時由靜脈采血5 ml,置肝素化試管中,離心10min(3500 r·min-1),分離血漿,于-70℃冰箱中保存待測。

1.4 血藥濃度測定

1.4.1 色譜條件

色譜柱:依利特ODS(250×4.6 mm,5 μm);預(yù)柱:C18 保護(hù)柱;流動相:0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液(磷酸調(diào)pH值2.60 ± 0.05)-乙腈(85:15);檢測波長:280 nm;柱溫:30 ℃;流速:1.0 ml/min;進(jìn)樣量:50 μl。

1.4.2 血漿樣品處理

精密量取血漿樣品500 μl,加入甲醇-水(1:1)100 μl,加入內(nèi)標(biāo)溶液(100.2000 μg/ml頭孢拉定)50 μl,20 %三氯醋酸100 μl,漩渦混合1分鐘,14000 rpm離心6分鐘,取上層液轉(zhuǎn)置于10 ml離心管中,依次加入乙腈0.5 ml和二氯甲烷2 ml,振蕩6分鐘,12000 rpm離心6分鐘,取上層液轉(zhuǎn)置于1.5 ml離心管中,14000 rpm離心6分鐘,取50 μl上清液進(jìn)樣分析。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取空白血漿500 μl,分別加入頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各50 μl,配制成血漿中頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體濃度為0.1000,0.3000,1.0000,2.0000,4.0000,8.0000,16.0000 μg/ml和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體濃度為20.0,40.0,100.0,200.0,400.0,1000.0,1600.0 ng/ml的血漿樣品,按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下自“加入內(nèi)標(biāo)溶液(100.0000 μg/ml頭孢拉定)50 μl”起同法試驗(yàn),每一濃度進(jìn)行雙樣本分析,制備頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測物濃度為橫坐標(biāo)X,待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(AS/Ai)為縱坐標(biāo)Y,用加權(quán)最小二乘法[2](權(quán)重系數(shù):1/X2)進(jìn)行線性回歸運(yùn)算,求得的線性回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。結(jié)果表明,頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體在0.1000 ~ 16.0000 μg/ml范圍內(nèi)、頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體在20.0 ~ 1600.0 ng/ml范圍內(nèi)分別與待測物和內(nèi)標(biāo)物峰面積之比線性關(guān)系良好,濃度測定結(jié)果均達(dá)到試驗(yàn)要求的精密度與準(zhǔn)確度[3]。

1.4.4 精密度與準(zhǔn)確度

精密量取空白血漿500 μl,分別加入不同濃度的頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和反式(E)異構(gòu)體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μl,配制成血漿中頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體濃度為0.2000,1.6000和12.8000 μg/ml、頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體濃度為50.0,300.0和1280.0 ng/ml的血漿樣品(每濃度六樣本分析),按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下自“加入內(nèi)標(biāo)溶液(100.0000 μg/ml頭孢拉定)50 μl”起同法試驗(yàn),連續(xù)測定三批(與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定同時進(jìn)行),計(jì)算血漿樣品的濃度,求得方法的精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果表明,頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體的低、中、高3個濃度QC樣品的批內(nèi)、批間RSD均小于15%,符合有關(guān)的國際規(guī)范要求[3]。

1.4.5 提取回收率

精密量取空白血漿500 μl,分別加入不同濃度的頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和反式(E)異構(gòu)體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μl,配制成血漿中頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體濃度為0.2000,1.6000和12.8000 μg/ml,頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體濃度為50.0,300.0和1280.0 ng/ml的血漿樣品(每濃度六樣本分析),按“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下自“加入內(nèi)標(biāo)溶液(100.2000 μg/ml頭孢拉定)50 μl”起同法試驗(yàn),獲得相應(yīng)色譜峰面積;另取對應(yīng)濃度的頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 μl,加入內(nèi)標(biāo)溶液(100.0000 μg/ml頭孢拉定溶液)50 μl,甲醇-水(1:1)600 μl(每濃度六樣本分析),渦旋混合30秒,取50 μl上清液進(jìn)樣分析,獲得相應(yīng)色譜峰面積(六次測定的平均值)。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。結(jié)果表明,3種濃度下頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體的提取回收率分別為95.1%,94.9%和96.0%;頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體分別為92.9%,94.1%和92.7%,內(nèi)標(biāo)提取回收率為91.0,符合有關(guān)規(guī)定[3]。

1.4.6 血漿樣品的穩(wěn)定性

制備低、中、高3個濃度的血漿樣品各3份,共配制3組,分別進(jìn)行室溫、反復(fù)凍融及-70℃凍存條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果測定RSD均在15%以內(nèi),表明頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體血漿樣品在室溫放置24 h、反復(fù)凍融3次及-70℃凍存條件下31天均穩(wěn)定性良好。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Phoenix WinNonlin 6.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件處理血藥濃度數(shù)據(jù)并進(jìn)行計(jì)算。Tmax和Cmax均為實(shí)測值,藥-時曲線下面積(AUC0-t)按梯形面積法計(jì)算。對Cmax、AUC的對數(shù)轉(zhuǎn)換值及Tmax的實(shí)測值進(jìn)行方差分析、雙單側(cè)t檢驗(yàn)和90%置信區(qū)間估計(jì),評價兩制劑的生物等效性。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

色譜圖結(jié)果表明,頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體保留時間為8.8分鐘左右,頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體的保留時間為13.8分鐘左右,頭孢拉定的保留時間為15.4分鐘左右,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體、反式(E)異構(gòu)體和內(nèi)標(biāo)物頭孢拉定的測定(A為頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體,B為頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體,C為頭孢拉定)。因此本方法具有良好的專屬性,符合測定要求。結(jié)果見圖1。

異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)的樣品色譜圖

(峰A為頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體;峰B 為羅頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體;峰C為頭孢拉定(內(nèi)標(biāo)))

(峰A為頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體;峰B 為羅頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體;峰C為頭孢拉定(內(nèi)標(biāo)))

2.2 血藥濃度-時間曲線

18名健康受試者單劑量口服頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體受試制劑和參比制劑后,平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

2.3 血藥濃度及藥代動力學(xué)參數(shù)

18名受試者單劑量口服受試制劑和參比制劑后頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體的主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表1。

2.4 生物等效性評價

以AUC0-t計(jì)算,頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體的相對生物利用度分別為102.2 % ± 13.7 %和103.5 % ± 15.2。對頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體的主要藥動學(xué)參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析,并進(jìn)一步采用雙單側(cè) t 檢驗(yàn)進(jìn)行生物等效性評價。頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體AUC0-t和AUC0-∞的90%置信區(qū)間為100.3%~110.7%和100.4%~110.6%;Cmax的90%置信區(qū)間為98.3%~112.8%和94.6%~103.9% ,Tmax在受試制劑與參比制劑間無顯著性差異。頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體的AUC0-t和AUC0-∞的90%置信區(qū)間為94.5%~103.6%和94.5%~103.7%,Cmax的90%置信區(qū)間為98.3%~112.8%和94.6%~103.9%,Tmax在受試制劑與參比制劑間無顯著性差異。

3 討論

血漿樣品處理時,如果不用乙腈和二氯甲烷除雜,色譜圖上待測物及內(nèi)標(biāo)處會有雜質(zhì)峰的干擾。本法提取回收率較高,且方法的重現(xiàn)性較好。與有關(guān)文獻(xiàn)比較[4],該法靈敏度高且選擇性好,完全可以滿足臨床藥代動力學(xué)的要求。

采用HPLC法研究頭孢丙烯片在健康志愿者體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程。結(jié)果表明,18名健康男性志愿者分別口服0.5g頭孢丙烯片受試制劑與參比制劑后,兩制劑的主要藥代動力學(xué)參數(shù)(Cmax,AUC)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后,方差分析結(jié)果表明頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體在兩種制劑間、周期間無顯著性差異(P>0.05),個體間有顯著性差異(P<0.05),說明兩藥物在人體內(nèi)的吸收分布過程基本相似;經(jīng)雙單側(cè)t檢驗(yàn)和[1-2α] 置信區(qū)間分析,頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體受試制劑的AUC0-t和AUC0-∞的90%置信區(qū)間在參比制劑相應(yīng)參數(shù)的80%~125%內(nèi),表明頭孢丙烯順式(Z)異構(gòu)體和頭孢丙烯反式(E)異構(gòu)體受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

在臨床試驗(yàn)過程中,醫(yī)生對受試者進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)護(hù),未觀察到臨床不良反應(yīng)現(xiàn)象;受試者在試驗(yàn)后進(jìn)行體檢,檢測指標(biāo)有超出正常值范圍者,經(jīng)臨床醫(yī)生判斷無臨床意義。

參考文獻(xiàn)

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