劉 丹 張 慰 孟冠敏 姜 凱 金 鑫 浙江省立同德醫(yī)院 杭州310012

水飛薊賓誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2死亡及機(jī)制研究

劉 丹 張 慰 孟冠敏 姜 凱 金 鑫 浙江省立同德醫(yī)院 杭州310012

目的 探討水飛薊賓對人肝癌細(xì)胞HepG2的殺傷作用及其機(jī)制。方法 不同濃度水飛薊賓處理HepG2細(xì)胞，采用MTT法檢測HepG2細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測水飛薊賓誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡情況。利用ROS熒光探針二氫乙啶（DHE）檢測水飛薊賓是否誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，并用ROS抑制劑抗壞血酸預(yù)處理后檢測水飛薊賓對HepG2的殺傷活性及誘導(dǎo)凋亡的能力。結(jié)果 水飛薊賓可顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。水飛薊賓處理后HepG2細(xì)胞的ROS顯著增高（P＜0.05，P＜0.01），用抗壞血酸預(yù)處理后水飛薊賓對HepG2的增殖抑制作用降低，并抑制水飛薊賓誘導(dǎo)的凋亡。結(jié)論 水飛薊賓通過誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生引起人肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

肝癌細(xì)胞；HepG2；凋亡；ROS；水飛薊賓

肝癌是危害人類健康的世界性難題，其預(yù)后差，生存時間較短，死亡率居所有惡性腫瘤的第3位[1]，手術(shù)、化療、放療等方法目前仍然是治療肝癌的主要手段，但長期化療副反應(yīng)很大，且易產(chǎn)生耐藥性，采取一系列輔助治療降低化療藥物用量以及提高治療效果顯得尤為重要。水飛薊賓（silibinin）是水飛薊素（silymarin）中最主要的生物活性成分，臨床上主要用于保肝護(hù)肝[2]。近年來，水飛薊賓還被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性，對于多種腫瘤均具有良好抑制作用[3-4]，然而其對肝腫瘤的抑制作用卻很少報道，且抗腫瘤作用的機(jī)制也不十分清楚。因此，筆者通過研究水飛薊賓對人肝癌細(xì)胞系HepG2的生物作用，觀察水飛薊賓誘導(dǎo)肝腫瘤細(xì)胞凋亡作用，報道如下。

1 實驗材料

1.1 細(xì)胞來源 人肝癌細(xì)胞株HepG2來自于ATCC，由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供，細(xì)胞培養(yǎng)在RPIM-1640培養(yǎng)基中，其中含有10%胎牛血清（FBS）。

1.2 試 劑 RPIM-1640培養(yǎng)基購自于Gibco公司，胎牛血清（FBS）購于杭州四季青生物工程有限公司。水飛薊賓（Silibinin）、噻唑藍(lán)（MTT）、抗壞血酸（ascorbic acid，AA）購于美國Sigma公司，二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）購于美國Molecular Probes公司。碘化丙啶（PI）和AnnexinⅤ購自美國ebioscience。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞生長抑制檢測 將HepG2細(xì)胞按1×104/孔接種于 96孔板，加入 200μL含 10%FBS的RPIM-1640培養(yǎng)，設(shè)置3個復(fù)孔，并分別加入0、10、20、50和100μM的Silibinin培養(yǎng)24h及48h，之后加5mg/mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，往孔中加150μL DMSO，震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570nm波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值，細(xì)胞生長抑制率計算公式：抑制率=（ODPBS-ODSilibinin）/ODPBS× 100%。

2.2 細(xì)胞凋亡及ROS產(chǎn)生檢測 在HepG2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入0、10、20、50和100μM的Silibinin培養(yǎng)24h，之后按照試劑說明書將PI和annexin-V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡[5]，細(xì)胞凋亡率用PI、annexin-V雙陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞比值表示；同時用DHE染料采用流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生情況[6]。DHE（二氫乙啶，Dihy droethidium）可自由透過活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子型ROS氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光，流式細(xì)胞檢測可分成兩個亞群：ROS陰性細(xì)胞僅有很低的熒光強(qiáng)度，ROS陽性細(xì)胞有較強(qiáng)的紅色熒光，ROS陽性率按照發(fā)出較強(qiáng)紅色熒光的細(xì)胞占所有細(xì)胞的比值表示。

在HepG2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中先加入1mM AA預(yù)處理2h,之后加入100μM的Silibinin培養(yǎng)24h，檢測Silibinin對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性、ROS的產(chǎn)生及凋亡。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有實驗重復(fù)三次，實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，采用非配對雙邊t檢驗以及單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 水飛薊賓對人肝癌細(xì)胞系HepG2的抑制作用HepG2細(xì)胞在不同濃度Silibinin的作用下相比于0μm Silibinin組均呈現(xiàn)出抑制效應(yīng)（P＜0.05，P＜0.01），用Silibinin處理48h較24h抑制作用更加明顯（P＜0.05，P＜0.01），提示Silibinin對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用有劑量和時間依賴性。見表1。

3.2 水飛薊賓對肝癌細(xì)胞HepG2活性氧簇（ROS）生成及凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng) HepG2細(xì)胞在不同濃度Silibinin的作用下相比于0μm Silibinin組ROS產(chǎn)生明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），其陽性率隨著水飛薊賓濃度的增加而升高，表明水飛薊賓能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ROS產(chǎn)生且呈劑量依賴性。相似地，在Silibinin的處理下，HepG2細(xì)胞的凋亡率也隨著Silibinin劑量的增加而增加（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表1 各組HepG2腫瘤細(xì)胞抑制率比較（±s）

表1 各組HepG2腫瘤細(xì)胞抑制率比較（±s）

注：與0μM Silibinin組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與同濃度水飛薊賓處理24h的抑制率比較，△P＜0.05，△△P＜0.01 Silibimin：水飛薊賓

組 別n/孔24h抑制率/%48h抑制率/% 0μM Silibinin組10μM Silibinin組20μM Silibinin組50μM Silibinin組100μM Silibinin組33333 0 5.1±1.5* 11.5±2.7* 28.6±3.5** 56.3±6.7** 0 11.7±2.4*△20.8±3.9**△60.2±5.2**△△79.5±7.4**△△

表2 各組HepG2腫瘤細(xì)胞凋亡率比較（±s）

表2 各組HepG2腫瘤細(xì)胞凋亡率比較（±s）

注：與0μM Silibinin組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 Silibimin：水飛薊賓

組 別n/孔ROS陽性率/%HepG2凋亡率/% 0μM Silibinin組10μM Silibinin組20μM Silibinin組50μM Silibinin組100μM Silibinin組33333 1.3±0.2 4.8±1.1* 14.8±2.9* 22.1±4.0** 33.5±4.2** 0.5±0.1 3.0±0.6* 10.1±2.0** 20.7±4.4** 29.4±4.5**

3.3 抗壞血酸（AA）抑制ROS產(chǎn)生與細(xì)胞凋亡作用

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)相比于未加AA直接加Silibinin的HepG2細(xì)胞，用AA預(yù)處理過的HepG2細(xì)胞在用Silibinin治療后ROS產(chǎn)生明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），凋亡率和對Silibinin的敏感性也同樣明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表3。

4 討 論

在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)水飛薊賓能快速引起肝腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激，進(jìn)而使肝腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS。ROS能損傷細(xì)胞的DNA和酶，干擾細(xì)胞的代謝過程，從而誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡[7]，此外ROS還可以引起下游凋亡誘導(dǎo)通路的激活來促進(jìn)細(xì)胞死亡，比如ROS可以引起細(xì)胞線粒體失能[8]及激活MAPK途徑來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]，這些已經(jīng)被證實存在于各種類型的腫瘤細(xì)胞中，因此給予腫瘤細(xì)胞足夠的氧化應(yīng)激，使之產(chǎn)生過量的活性氧簇進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡是現(xiàn)在腫瘤治療的一個十分重要的思路。

表3 ROS對水飛薊賓誘導(dǎo)HepG2凋亡的影響（±s）

表3 ROS對水飛薊賓誘導(dǎo)HepG2凋亡的影響（±s）

注：與PBS組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與Silibinin組比較，▲P＜0.01 PBS：胎牛血清；AA：抗壞血酸；Silibimin：水飛薊賓

組別PBS組AA組Silibinin組AA+Silibinin組n/孔AA濃度/mM Silibinin濃度/μM 3333 0101 00 100 100 ROS陽性率/% 1.3±0.2 0.3±0.1 33.5±4.2** 6.7±2.2*▲HepG2抑制率/% 0 -0.6±0.2 56.3±6.7** 11.4±2.8**▲HepG2凋亡率/% 0.5±0.1 0.4±0.1 29.4±4.5** 7.1±2.6**▲

抗壞血酸（AA）是人體必需的一種高效抗氧化劑，保護(hù)身體免于自由基的威脅，然而最近的研究發(fā)現(xiàn)AA能通過降低腫瘤細(xì)胞ROS的產(chǎn)生從而降低化療藥物的療效[10]。水飛薊賓是從水飛薊屬植物種子中提取的一種黃酮類化合物，臨床上主要用來保護(hù)肝細(xì)胞，對黃疸、肝炎、酒精肝等疾病有良好的療效，是一種低毒安全的肝臟治療藥物[11]。本組結(jié)果顯示，Silibinin可抑制HepG2腫瘤細(xì)胞增殖，并通過誘導(dǎo)HepG2產(chǎn)生ROS，促進(jìn)HepG2凋亡。但AA可以干擾Silibinin的抗增殖與促凋亡作用。

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Silibinin Induced Cell Death in Hepatoma Cell line HepG2 and Its Mechanism

LIU Dan，ZHANG Wei，MENGGuan Min,JIANG Kai,JIN Xin.Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

Objective To investigate the effect of silibini on proliferation of HepG2 cells and the underlying mechanism.Methods HepG2 cells were treated with various concentrations of silibinin;then the proliferation of HepG2 cells treated with silibinin was determined by using MMT assay and the apoptosis of HepG2 cells was detected by flow cytometry.The generation of ROS in HepG2 cells induced by silibinin was observed by using fluorescent probe with DHE and then was inhibited by ascorbic acid to observe whether the effect of silibinin on proliferation of HepG2 cells was dependent on ROS.Results Silibinin significantly inhibited the proliferation of HepG2 cells,inducing apoptotic cell death.The ROS significantly increased in HepG2 cells treated with silibinin（P＜0.05,P＜0.01）.After ascorbic acid treatment,the suppression as well as apoptosis of HepG2 cells induced by silibinin decreased.Conclusion Silibinin can induce apoptotic cell death of HepG2 cells via upregulating ROS.

hepatocarcinoma cells；HepG2；apoptosis；ROS；silibinin

2014-06-13

2014-06-30