周 凡 方 偉 祝光禮 赫小龍 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院心血管科 杭州 310007

參附強(qiáng)心合劑對心衰大鼠水通道蛋白2水平的影響

周 凡 方 偉 祝光禮 赫小龍 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬廣興醫(yī)院心血管科 杭州 310007

目的 觀察參附強(qiáng)心合劑對心衰大鼠心功能及水通道蛋白2（AQP-2）水平的影響，探討參附強(qiáng)心合劑抗心衰水潴留的作用機(jī)制。方法 用腹主動(dòng)脈縮窄法制作心衰大鼠模型，造模成功60只大鼠隨機(jī)分為參附強(qiáng)心合劑大、中、小劑量組，氯沙坦組和模型組，每組12只。前三組分別按成人用藥劑量20、10、5倍的參附強(qiáng)心合劑14g/（kg·d）、7g/（kg·d）、3.5g/（kg·d）灌胃；氯沙坦組以成人劑量10倍的氯沙坦10mg/（kg·d）灌胃；模型組以蒸餾水灌胃。另假手術(shù)組大鼠12只以蒸餾水灌胃作為空白對照組。給藥4周后，心超檢查測定左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），ELISA法檢測大鼠尿AQP-2濃度，Western blot檢測大鼠腎臟AQP-2表達(dá)水平。結(jié)果 參附強(qiáng)心合劑可改善心衰大鼠心功能，其各劑量組大鼠尿AQP-2濃度及腎臟AQP-2表達(dá)水平均明顯下降（P＜0.01或P＜0.05）；隨參附強(qiáng)心合劑劑量的增加，AQP-2濃度逐漸下降，EF值逐漸升高；EF值與AQP-2間有良好的線性負(fù)性相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。結(jié)論 參附強(qiáng)心合劑可有效改善心衰大鼠心功能，降低AQP-2濃度，且呈一定的劑量依賴性；其作用機(jī)制與降低心衰大鼠AQP-2濃度有關(guān)。

大鼠；心衰；水潴留；水通道蛋白2；參附強(qiáng)心合劑

心力衰竭（心衰）是一種復(fù)雜的臨床癥狀群，是各種心臟病發(fā)展的嚴(yán)重階段，發(fā)病率高，5年存活率與惡性腫瘤相仿。我們前期研究證實(shí)，參附強(qiáng)心合劑能降低患者循環(huán)腎素、PRA、AngⅡ、E、NE水平，抑制心衰時(shí)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的過度激活，改善心衰患者臨床癥狀。本研究通過腹主動(dòng)脈縮窄法制備大鼠心力衰竭模型，觀察參附強(qiáng)心合劑對心衰大鼠心功能及其AQP-2的影響，探討其對心衰水潴留機(jī)制的調(diào)節(jié)作用，以期進(jìn)一步闡釋該方治療心力衰竭的機(jī)制，為中醫(yī)藥治療心衰提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠72只，體質(zhì)量130～160g，無人畜共患疾病，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號：SCXK（浙）2008-0033。分籠飼養(yǎng)，保持室內(nèi)環(huán)境恒溫（19±3）℃，濕度在50%～60%，通風(fēng)良好，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要藥物及試劑 氯沙坦鉀片（100mg/片，杭州默沙東制藥有限公司，批號H20100361）；參附強(qiáng)心合劑（紅參3g，附子5g，葶藶子10g，玉竹15g，將各藥加水煎煮，首煎1.5h，二煎0.5h。濃縮成2g/mL的生藥煎劑。由杭州市中醫(yī)院制劑室提供）；大鼠水通道蛋白2（AQP-2）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（R&D公司，批號RT201106121）；大鼠水通道蛋白2（AQP-2）for Western blot（美國Cell signal公司，批號46098）；BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號22610240）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造 模 72只SD大鼠隨機(jī)取12只作為假手術(shù)組，其余為手術(shù)組。大鼠腹主動(dòng)脈縮窄心衰模型的制作參照參考文獻(xiàn)[1-3]并略作改進(jìn)。假手術(shù)組開腹后僅分離腹主動(dòng)脈而不行縮窄術(shù)。所有大鼠均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)飼料常規(guī)喂養(yǎng)，于術(shù)后4周，取12只手術(shù)大鼠及假手術(shù)組大鼠行超聲心動(dòng)圖檢查，記錄左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左室短軸縮短率（FS）和左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。若手術(shù)大鼠心功能較假手術(shù)組明顯下降提示造模成功。

2.2 分組及給藥 造模成功大鼠60只按隨機(jī)數(shù)字表法分為參附強(qiáng)心合劑大、中、小劑量組，氯沙坦組和模型組，每組12只。前三組分別按成人用藥劑量20、10、5倍劑量的參附強(qiáng)心合劑以14g/（kg·d）、7g/（kg·d）、3.5g/（kg·d）灌胃；氯沙坦組以成人劑量10倍的氯沙坦10mg/（kg·d）灌胃；模型組以蒸餾水灌胃。另假手術(shù)組大鼠以蒸餾水灌胃作為空白對照組。給藥時(shí)間4周。

2.3 大鼠心超檢查 給藥4周后，對各組大鼠行超聲心動(dòng)圖檢查，測量并記錄左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、左室短軸縮短率（FS）和左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

2.4 各組大鼠尿液AQP-2測定 采用雙抗體夾心ELISA法。末次給藥24h后，留取大鼠末次尿液標(biāo)本，于4℃下3000r/min離心15min，吸取上清液，分別加100μL標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品于相應(yīng)反應(yīng)孔中，置37℃恒溫水浴箱反應(yīng)120min，洗板后加酶標(biāo)抗體工作液，將反應(yīng)板置37℃恒溫水浴箱反應(yīng)60min，再洗板，加入底物工作液顯色后終止，所得OD值減去空白值后為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，測定大鼠尿液AQP-2含量。

2.5 各組大鼠腎臟AQP-2蛋白表達(dá)測定 末次給藥24h后處死大鼠取腎臟標(biāo)本，稱取100mg腎臟組織，液氮研磨成粉，放入EP管中，加入500μL細(xì)胞裂解液，冰浴30min，每5min EP管劇烈震蕩15s，然后4℃12 000g，離心25min，取上清，BCA法求得各樣本蛋白濃度。每組取50μg樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后半干式轉(zhuǎn)膜，加入相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，繼加入二抗置于水平搖床上3檔慢速孕育，室溫1.5h，后洗滌3次，ECL顯影，膠片掃描后，Image J軟件進(jìn)行圖像分析，以β-actin作為內(nèi)參照對比，比值結(jié)果表示其蛋白的相對含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠心功能比較 給藥4周后，大鼠心超檢查提示，與模型組比較，參附強(qiáng)心合劑各劑量組及氯沙坦組LVEDD均有下降（P＜0.05）、FS、EF均有上升（P＜0.05）；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠FS、EF值明顯下降，LVEDD值明顯升高（P＜0.05），證實(shí)造模成功。參附強(qiáng)心合劑大劑量組和氯沙坦組LVEDD、FS、EF值與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），參附強(qiáng)心合劑大劑量組EF與氯沙坦組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。參附強(qiáng)心合劑各劑量組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但存在FS、EF值隨參附強(qiáng)心合劑劑量的提高而升高，LVEDD值隨參附強(qiáng)心合劑劑量的提高而降低的趨勢，說明參附強(qiáng)心合劑改善心功能的作用存在一定的劑量依賴性，見表1。

3.2 各組大鼠尿液AQP-2濃度比較 與模型組比較，參附強(qiáng)心合劑各劑量組、氯沙坦組尿液AQP-2濃度均明顯下降（P＜0.01）；與假手術(shù)組比較，參附強(qiáng)心合劑大劑量組和氯沙坦組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），氯沙坦組與參附強(qiáng)心合劑大劑量組比較尿液AQP-2濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。參附強(qiáng)心合劑大、中劑量組尿液AQP-2濃度顯著低于小劑量組（P＜0.01），見表2。

表1 各組大鼠心功能比較（±s）

表1 各組大鼠心功能比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，▽P＜0.05

組別參附強(qiáng)心合劑大劑量組參附強(qiáng)心合劑中劑量組參附強(qiáng)心合劑小劑量組氯沙坦組模型組假手術(shù)組n/只12 12 12 12 12 12 LVEDD/mm 6.02±0.41* 6.26±0.52* 6.38±0.41*▽5.93±0.46* 6.85±0.53▽5.82±0.32** FS/% 38.40±7.73* 36.64±5.88*▽35.50±5.77*▽40.53±5.94* 27.53±5.17▽43.65±6.32** LVEF/% 73.99±7.40* 68.11±6.05*▽65.18±6.82*▽76.64±6.26* 57.30±8.29▽80.86±5.97*

表2 各組大鼠尿液AQP-2濃度比較（±s）

表2 各組大鼠尿液AQP-2濃度比較（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01；與參附強(qiáng)心合劑小劑量組比較，▲▲P＜0.01

組別參附強(qiáng)心合劑大劑量組參附強(qiáng)心合劑中劑量組參附強(qiáng)心合劑小劑量組氯沙坦組模型組假手術(shù)組n/只666666 AQP-2（ng/mL）4.972±0.356**▲▲5.430±0.408**▽▽▲▲6.896±0.495**▽▽4.894±0.281** 8.380±0.310▽▽4.527±0.323**

3.3 EF值與AQP-2濃度相關(guān)性分析 模型組EF值較參附強(qiáng)心合劑各劑量組、氯沙坦組及假手術(shù)組均明顯下降，尿AQP-2值較參附強(qiáng)心合劑各劑量組、氯沙坦組及假手術(shù)組均明顯升高。用藥4周后，參附強(qiáng)心合劑各劑量組、氯沙坦組及假手術(shù)組EF值較模型組均改善，其升高程度與尿AQP-2下降程度呈線性負(fù)性相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），見圖1。

圖1 大鼠EF值與尿AQP-2相關(guān)性（r=0.95，P＜0.01）

3.4 各組大鼠腎臟AQP-2蛋白表達(dá)量比較 與模型組比較，參附強(qiáng)心合劑各劑量組、氯沙坦組、假手術(shù)組腎臟組織AQP-2表達(dá)均明顯下降（P＜0.01）；與氯沙坦組比較，參附強(qiáng)心合劑大劑量組AQP-2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；參附強(qiáng)心合劑各劑量組間兩兩比較，參附強(qiáng)心合劑大劑量組AQP-2蛋白表達(dá)水平顯著低于中、小劑量組（P＜0.01），且存在AQP-2蛋白表達(dá)水平隨參附強(qiáng)心合劑劑量增加而降低的趨勢，說明參附強(qiáng)心合劑下調(diào)AQP-2蛋白表達(dá)水平的作用存在劑量依賴性。見表3，圖2。

表3 各組大鼠腎臟組織AQP-2蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠腎臟組織AQP-2蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與假手術(shù)組比較，▽P＜0.05，▽▽P＜0.01；與參附強(qiáng)心合劑大劑量組比較，☆☆P＜0.01

組 別n/只AQP-2/β-actin參附強(qiáng)心合劑大劑量組參附強(qiáng)心合劑中劑量組參附強(qiáng)心合劑小劑量組氯沙坦組模型組假手術(shù)組666666 0.066±0.004**▽0.195±0.019**▽▽☆☆0.225±0.018**▽▽☆☆0.064±0.007**▽1.399±0.306▽▽0.050±0.009**

圖2 各組大鼠腎臟組織AQP-2蛋白表達(dá)1～6組別依次為：參附合劑大劑量組、中劑量組、小劑量組、氯沙坦組、假手術(shù)組、模型組。

4 討論

水鈉潴留是充血性心力衰竭（CHF）最重要的病理生理改變之一，也是心源性水腫的最主要發(fā)病機(jī)制，同時(shí)還是充血性心力衰竭出現(xiàn)癥狀的重要原因，并可導(dǎo)致心臟功能的進(jìn)一步受損。中醫(yī)認(rèn)為，陽氣具有溫化水液的作用，腎主水，腎陽在水液代謝過程中起著極其重要的作用，故有腎為水臟之說。生理狀態(tài)下的心陽腎陽相溫相助，心陰腎陰相滋相煦，從而達(dá)到心腎相交、水火互濟(jì)的協(xié)調(diào)生理狀態(tài)，在病理狀態(tài)下心腎兩臟也相互制約，相互影響，從而心病及腎，腎病及心，最終導(dǎo)致心腎俱病。研究[4]認(rèn)為心衰以水濕為病，強(qiáng)調(diào)利水滲濕是主要環(huán)節(jié)，提出溫陽化氣，調(diào)暢氣血，通利三焦，宣氣利水等清利水濕4法，分別治療腎虛不主氣化，水液不行；陽虛水泛，水氣凌心；肝郁氣滯，水痕交濁；濕濁彌漫三焦；濕邪遏阻氣機(jī)，表里皆有濕?；騼?nèi)有水濕，兼有表氣不通之證?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，水通道蛋白2（AQP-2）是與心衰過程中水潴留密切相關(guān)的主要體液因子之一。研究證實(shí)，AQP-2是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)水重吸收作用的關(guān)鍵性靶蛋白，是充血性心力衰竭水潴留機(jī)制中最重要的效應(yīng)因子。迄今為止，已在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白（AQP0～AQP12），AQP-2是其中的重要成員之一，是由Fushimi1993年克隆確認(rèn)的水通道蛋白家族中的一種[5]。AQP-2在腎中大量分布，主要位于腎臟集合管（CD）主細(xì)胞管腔側(cè)和靠近管腔側(cè)的囊泡內(nèi)，是血管加壓素（AVP）依賴性水通道，也是調(diào)節(jié)腎臟集合管對水通透性的關(guān)鍵蛋白，在調(diào)節(jié)腎臟水平衡中起重要作用，被認(rèn)為是維持人體內(nèi)水平衡的必須物質(zhì)[6]。CHF時(shí)水潴留機(jī)制的主要途徑為：心輸出量下降→血中AVP增加→腎集合管主細(xì)胞V2受體激活→AQP-2激活/或基因表達(dá)上調(diào)→水重吸收增加→水潴留[7]。因此，CHF過程中的體液因子會(huì)隨著CHF的進(jìn)展而發(fā)生進(jìn)行性改變，且在一定程度上可以反映CHF的嚴(yán)重程度。這與中醫(yī)對于心衰的病機(jī)和診治的認(rèn)識存在著一致性。

參附強(qiáng)心合劑由歷史名方參附湯加葶藶子、玉竹而來。參附湯源于《婦人良方》，功能回陽救逆、益氣固脫；葶藶子平喘利水，使肺氣清肅，水道通調(diào)；玉竹滋養(yǎng)心陰，又能牽制附子助陽太過。諸藥合用，共奏益氣溫陽利水之功，并兼顧心陰。本研究結(jié)果顯示，參附強(qiáng)心合劑明顯改善慢性心衰模型大鼠心功能，表現(xiàn)為左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）下降，左室短軸縮短率（FS）及左室射血分?jǐn)?shù)（EF）升高（P＜0.05），且兩者之間存在一定的劑量依賴性，而參附強(qiáng)心合劑大劑量改善心功能的作用與氯沙坦相當(dāng)。結(jié)果進(jìn)一步表明，參附強(qiáng)心合劑大、中、小劑量組均可以降低心衰大鼠AQP-2濃度，并呈一定的劑量依賴性，其中大劑量組效果優(yōu)于中、小劑量組（P＜0.01）；參附強(qiáng)心合劑大劑量降低AQP-2濃度的作用與氯沙坦相當(dāng)。

本研究顯示，參附強(qiáng)心合劑可改善心衰大鼠心功能，其作用機(jī)制之一可能通過下調(diào)腎臟管腔膜上的AQP-2，使水通道關(guān)閉，通透性下降，水重吸收減少，尿量增多，尿液稀釋，尿液中AQP-2相應(yīng)減少，從而發(fā)揮抗心衰水潴留的作用。

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Effects of Shenfu Qiangxin Decoction on Concentration of Urinary Aquaporin 2 in Chronic Heart Failure Rats

ZHOU Fan,FANG Wei,ZHU Guang-li,HE Xiaolong. Guangxing Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310007),China

Objective To investigate the effect of Shenfu qiangxin（SFQX）decoction on cardiac function and the level of urinary aquaporin 2 in chronic heart failure（CHF）rat model,in an attempt to explore the underlying mechanism of SFQX decoction on water retention in CHF.Methods Sixty CHF models in male adult SD rats were made by coarctation of abdominal aorta（CAA）and then were randomly divided into 5 groups:SFOX groups（large,medium,and low dose）,losarton group,and model group.Another 12 SD rats received sham operation. Large-,medium-,and low-dose SFQX groups were intragastically given 14,7 and 3.5 g·kg-1·d-1SFQX decoction, losarton group was given 10 mg·kg-1·d-1of losarton,and model group and sham group were grive 2 mL/d of sterile purified water.At the end of 4 weeks,the cardiac function was measured by ultrasonic echocardiogram,and AQP-2 was detected by ELISA and western blot.Results Comparing with model group,the cardiac function were improved in SFQX groups;the concentration of urinary AQP-2 and the expression of AQP-2 in renal tissue were reduced（P＜0.01 or P＜0.05）.The concentration of AQP-2 reduced but ejection fraction（EF）increased correspondingly with the increase of the dose of SFQX decoction.There was a remarkable negative correlation between EF and the concentration of urinary AQP-2（P＜0.01）.Conclusion SFQX decoction can improve the cardiac function and reduce the concentration of AQP-2 in CHF rat model in a dose-dependent manner.The mechanism of SFQX decoction on water retention in CHF rats may be related to reduce the concentration of AQP-2.

rats；heart failure；water retension；Aquaporin 2；Shenfu Qiangxin decoction

2014-05-24

修回日期：2014-07-14

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2010ZA093）

周凡，Tel：13186988396，E-mail：ff.zhou@163.com