李媛媛，郭 晶，李旭勇，王金良，范 俊，梁立濱，鄧國(guó)華，施建忠，陳化蘭

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒所引起的一種禽源性疾病，根據(jù)HA和NA的抗原差異可將禽流感病毒(AIV)分為17個(gè)H亞型和10個(gè)N亞型[1]。雖然家禽中感染H7N9亞型AIV已有報(bào)道，但2013年以前，并未發(fā)現(xiàn)其感染人的情況[2]。2013年3月，在上海、安徽兩地出現(xiàn)急性呼吸道感染患者，后被證實(shí)為新型H7N9 AIV感染[3]，截止10月25日，出現(xiàn)人感染H7N9亞型AIV 137例，死亡45例，死亡率高達(dá)33%。這種新型流感病毒的遺傳背景十分復(fù)雜，是一種多元重組病毒，其HA基因與H7N3具有很高的同源性，NA基因與H4N9、H7N9、H11N9均具有很高的同源性，其內(nèi)部基因來源于H9N2[4-5]。這種對(duì)家禽呈現(xiàn)低致病力的病毒很容易在禽類中存在卻因無癥狀而不被注意，但其對(duì)人卻具有很高的致病力甚至死亡率[6]，因此建立H7N9亞型AIV反向遺傳操作系統(tǒng)對(duì)該病毒致病機(jī)理和跨宿主傳播機(jī)制的研究以及研制重組疫苗候選株至關(guān)重要。

本研究以H7N9亞型AIV CK/53為親本病毒株，通過建立反向遺傳操作系統(tǒng)，為今后對(duì)病毒表型的核酸水平因素的研究提供技術(shù)平臺(tái)。構(gòu)建的H7N9亞型AIV疫苗候選株CK53/PR8，為進(jìn)一步的免疫保護(hù)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要實(shí)驗(yàn)材料 A/chicken/Shanghai/S1053/2013(CK/53)由本實(shí)驗(yàn)室分離和保存；PR8反向遺傳操作系統(tǒng)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[7]；雙向表達(dá)載體pBD、293T、MDCK、A549細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；10日齡SPF雞胚由本研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。病毒操作均在動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV、RNaseOUT、LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；BSPQI酶、Klenow大片段酶、Phusion高保真DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和T4 DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司；小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒、膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自Qiagen公司。引物由上海英竣生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 病毒基因的擴(kuò)增 提取CK/53株病毒總RNA，按M-MLV試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物序列為：5'-AGCAAAAGCAGG-3'。根據(jù)CK/53的各片段序列設(shè)計(jì)引物，每對(duì)引物在上游5'端增加2個(gè)堿基CC，在下游3'端增加2個(gè)堿基TT。以病毒反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行8個(gè)基因片段的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用DNA膠回收試劑盒純化回收。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)[7]中的方法將病毒各節(jié)段基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆于pBD載體中，陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)中提后用于轉(zhuǎn)染。

1.5 病毒和疫苗候選株的救獲以及序列鑒定 按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將CK/53的8個(gè)重組質(zhì)粒0.5 μg混合，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后將細(xì)胞液接種10日齡SPF雞胚，0.4 mL/枚，37℃培養(yǎng)，48 h后取尿囊液進(jìn)行血凝(HA)試驗(yàn)，收集HA結(jié)果呈陽(yáng)性的雞胚尿囊液分裝后于-70℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)，提取救獲病毒的RNA，擴(kuò)增病毒基因組的8個(gè)節(jié)段，膠回收后測(cè)序，利用DNAStar軟件比較救獲病毒與親本病毒核苷酸序列是否一致。

按上述方法，將來自CK/53的表面基因(pBDHA和pBD-NA)與來源PR8的6個(gè)內(nèi)部基因共轉(zhuǎn)染，救獲重組疫苗株。

1.6 拯救病毒與疫苗候選株生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將拯救病毒以MOI=0.001感染MDCK和A549細(xì)胞，分別于12 h、24 h、48 h、72 h收取細(xì)胞上清液，并繪制病毒生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 CK/53基因8重組質(zhì)粒構(gòu)建和病毒拯救及鑒定用針對(duì)CK/53的引物對(duì)病毒8節(jié)段基因進(jìn)行擴(kuò)增(圖1)，并將CK/53的8個(gè)片段處理后分別與處理好的pBD載體連接，構(gòu)建成8質(zhì)粒雙向表達(dá)重組質(zhì)粒，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定與親本病毒株一致。利用反向遺傳操作技術(shù)拯救出rCK/53，在雞胚繁殖一代后，血凝價(jià)達(dá)到28，提取RNA、反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增病毒的全基因組片段進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與擴(kuò)增產(chǎn)物無任何缺失或突變。

2.2 疫苗候選株的拯救及全基因組序列測(cè)定 用CK/53的含有HA、NA基因的重組質(zhì)粒和來源于PR8的6個(gè)內(nèi)部基因的重組質(zhì)粒，8個(gè)片段拯救出候選疫苗株，擴(kuò)增病毒的全基因組片段，測(cè)序結(jié)果與親本病毒完全一致。

2.3 拯救病毒與疫苗候選株在MD CK和A 549細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線 拯救病毒與候選疫苗株在MDCK中，48 h和72 h病毒復(fù)制差異明顯；在A549中的復(fù)制速度基本相同(圖2)。

2013年暴發(fā)的H7N9 AI對(duì)人類和家禽的養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害，本研究采用反向遺傳操作系統(tǒng)，以CK/53為親本病毒，救獲了rCK/53，為進(jìn)一步開展H7N9流感病毒跨宿主傳播機(jī)制和致病機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)；并且以PR8的內(nèi)部基因?yàn)楣羌?，以CK/53的表面基因?yàn)楣w，構(gòu)建了H7N9亞型AIV疫苗候選株CK53/PR8，為進(jìn)一步的疫苗評(píng)估試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

圖1 AIV CK/538節(jié)段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplifications of eight gene segments from AIV of CK/53 by PCR

圖2 拯救病毒與疫苗候選株在MDCK和A549細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線Fig.2 The cell growth curve in MDCK and A549 of the rCK53 and CK53/PR8

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