余松城，任 雅，牛 婷，夏 靜，吳瑞婷，楊曉林，易 林，鄒年莉，黃 勇*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 雅安 625014；2.四川省雅安市天全縣農(nóng)業(yè)局，四川 雅安 625500)

禽白血病(Avian leukosis，AL)主要由反轉(zhuǎn)錄病毒科禽甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬的AL病毒(ALV)及禽肉瘤病毒(RSV)等引起，以造成禽類造血組織中某些細(xì)胞成分過度增生的多種腫瘤性疾病為主[1]。自1998年以來，J亞群ALV(ALV-J)的出現(xiàn)給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的損失[2]。

J亞群AL在我國已廣泛存在，近幾年該病的流行日趨嚴(yán)重，由于ALV-J具有廣泛的宿主嗜性，目前我國黃羽雞、麻雞、白羽肉雞、海蘭褐等多個品系發(fā)生ALV-J的感染[3-4]。自2011年初以來，四川地區(qū)疑似雞J亞群AL病例頻發(fā)，各雞種均有發(fā)病，雞群ALV的感染率較高，病死率也相對較高。為了解近年來ALV-J的流行情況和病毒分子特征，我們從多個雞場采集樣品并進(jìn)行檢測，初步分析了ALV-Jgp85基因的分子特性。

1 材料和方法

1.1 病料樣品來源 2011年10月至2012年10月分別在四川部分地區(qū)的8個雞場采集疑似AL雞的700份血液樣本和84份組織樣本，采樣雞品種主要為三黃雞、白羽雞、藏雞、綠殼蛋雞、草科雞。

1.2 主要試劑 DNA Marker購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T載體及TaqDNA聚合酶購自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α由本實驗室保存。

1.3 引物設(shè)計與合成 參照文獻(xiàn)[5]方法設(shè)計用于檢測ALV-J的引物，JF：5'-GGATGAGGTGACTAA GAAAG-3'，JR：5'-CGAACCAAAGGTAACACACG-3'，其擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期為545 bp。根據(jù)GenBank中登錄的HPRS103(Z46390.1)的基因序列設(shè)計擴(kuò)增gp85基因引物，GP85-F：5'-GTGCGTGGTTATTATTTCCG-3'，GP85-R： 5'-CGGGCTGTCACACTCCATAG-3'，其擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期為924 bp。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 樣品的PCR檢測 將采集的樣品經(jīng)蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提方法提取樣品中ALV-J的前病毒基因組DNA，以其為模板采用檢測引物JF/JR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 gp85基因的克隆和測序[6]對ALV-J檢測為陽性的樣品采用GP85-F/GP85-R引物進(jìn)行擴(kuò)增，純化回收目的片段，克隆于pMD19-T載體中，陽性重組質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，將gp85基因測序結(jié)果利用DNAStar軟件進(jìn)行分析，并與國內(nèi)外23個參考病毒株的相應(yīng)核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行相似性分析,采用Clustal X和MEGA 3.1軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測結(jié)果 疑似AL病雞主要表現(xiàn)為生長緩慢，精神沉郁，蛋雞產(chǎn)蛋率不高，有個別雞爪部腫大，解剖后多數(shù)可見肝臟和脾臟腫大，有些在肝臟或脾臟有白色腫瘤，嚴(yán)重者腸系膜也出現(xiàn)腫瘤。各雞場病料樣品PCR檢測結(jié)果表明：血液樣品和組織樣品ALV-J檢出率分別為3.1%(22/700)和14.3%(12/84)。8個雞場全部檢測出ALV-J(表1)。

表1 樣品來源及檢測結(jié)果Table 1 Background of clinic samples and the ALV-J detection by PCR

本次調(diào)查顯示，ALV-J感染在四川地區(qū)比較普遍，雖然組織和血液樣本的檢出率不高，但由于該病水平傳播效率比其它亞群高，若不采取一定的防控措施，ALV-J的感染可在雞群中擴(kuò)大，使防控難度進(jìn)一步加大。

2.2 gp85基因測序結(jié)果分析 選取18個ALV-J陽性樣品測定gp85基因序列，與其它23個國內(nèi)外參考病毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果表明所測樣品gp85基因核苷酸序列同源性為87.7%～99.8%，氨基酸同源性為86.4%～99.2%；與J亞群原型病毒株HPRS-103的核苷酸同源性為87.3%～98.2%，氨基酸同源性為86.7%～97.2%；與其他J亞群分離株的核苷酸序列同源性為85.7%～97.1%，氨基酸同源性為84.5%～96.8%(圖1)。以HPRS-103為參考株，比對的氨基酸序列顯示7個氨基酸的高頻變異點(diǎn)，為第54、66、67、175、204、209和 246位氨基酸。此外，有些獨(dú)特的突變位點(diǎn)在采自四川的大部分測序樣品中呈現(xiàn)特征性的規(guī)律，分別位于第209位和246位。在18個測序樣品中，E209K/N點(diǎn)突變占83.33%(15/18)，其中突變?yōu)镵的有12個，突變?yōu)镹的有3個；E246K/N/A點(diǎn)突變占88.9%(16/18)，其中突變?yōu)镵的有12個、N的有3個及A的有1個。這些特征或可以作為四川地區(qū)ALV流行株的特征之一，生物學(xué)意義還有待于進(jìn)一步研究。

圖1 gp85基因核苷酸序列進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree based ongp85gene sequences of ALV-J

基于gp85基因的氨基酸序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹表明，四川部分地區(qū)18個樣品中測得的病毒序列主要分屬4類(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅵ)(圖1)。其中Ⅰ類分支樣品有11個，表明早期的病毒株仍在流行，并且占的比列較高(61.1%)。與美國分離株US4817處于同一分支的樣品有1個。Ⅲ類分支的樣品有5個，表明四川地區(qū)的病毒株仍在流行并且發(fā)生了變異。樣本SM雖然與其它樣本處于不同的分支，但它和美國分離株US7501處于同一分支。因此，四川地區(qū)近年來的流行株與國外的分離株有直接的聯(lián)系，這些樣本對應(yīng)的病毒株的來源可能還是從國外引種。同一地區(qū)的樣品的遺傳進(jìn)化也不同，如SM-1、SM-4和SM均來自石棉縣，但3者處于兩個不同的遺傳分支，出現(xiàn)這種情況與該地區(qū)的不同養(yǎng)殖場的雞苗的來源不同有關(guān)。但有的地方如鄉(xiāng)城的樣本序列均處于同一分支，據(jù)調(diào)查該地方出于藏雞保種的需要，沒有引進(jìn)外來血緣的雞種，樣品之間gp85基因變異較小?？傊?，2011年～2012年四川地區(qū)ALV-J的gp85基因存在明顯的遺傳多樣性，這些序列均與國外病毒株有關(guān)，但在沒有外來雞種引入的地區(qū)如鄉(xiāng)城縣，樣品之間的遺傳變異很小。為了減少ALV-J的變異速度、減少不同遺傳背景的ALV-J的混合感染及其由此帶來的致病性的改變，各祖代雞場要重視ALV-J的防控，特別是在育種過程中引入新的血緣時一定要先做好凈化工作[7]。

[1]Payne L N,Nair V.The long view:40 years of avian leukosis research[J].Avian Pathol,2012,41(1):11-19.

[2]Payne L N.HPRS-103:A retrovirus strikes back.The emergence of subgroup J avian leucosis virus[J].Avian Pathol,1998,27(1):36-45.

[3]Sun Shu-hong,Cui Zhi-zhong.Epidemiological and pathological studies of subgroup J avian leukosis virus infections in inese local"yellow"chickens[J].Avian Pathol,2007,36(3):221-226.

[4]Cheng Zi-qiang,Liu Jian-zhu.Tumors Associated with Avian Leukosis Virus Subgroup J in Layer Hens during 2007 to 2009 in China[J].Avian Pathol,2010,72(8):1027-1033.

[5]Smith L M,Brown S R.Development and application of polymerase chain reaction(PCR)test s for thedetection of subgroup J avian leucosis virus[J].Virus Res,1998,54(1):87-98.

[6]Pan Wei,Gao Yu-long,Qin Li-ting,et al.Genetic diversity and phylogenetic analysis of glycoprotein GP85 of ALV-J isolates from Mainland China between 1999 and 2010:Coexistence of two extremely different subgroups in layers[J].Vet Microbiol,2012,156(1-2):205-212.

[7]高玉龍，邵華斌，王笑梅，等.2009年我國部分地區(qū)禽白血病分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32(1)：32-35.