邵振文，譚力凱，粟 碩，曹 楠，周 晗，楊萌萌，張桂紅

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

流感病毒感染宿主靶細胞的首要條件是通過其血凝素與宿主細胞表面的唾液酸受體結(jié)合而侵入機體，該結(jié)合能力決定了流感病毒種間傳播的潛能[1]。一般認為流感病毒受體識別特異性應(yīng)與宿主的受體類型一致，人流感病毒主要結(jié)合人肺臟和上呼吸道上皮的細胞表面受體SAα2,6Gal唾液酸受體，而禽流感病毒(AIV)主要結(jié)合禽上呼吸道和腸道上皮細胞表面的SAα2,3Gal唾液酸受體[2]。由于豬體內(nèi)同時含有兩種類型的受體，豬被認為是流感病毒的“中間宿主”[3]。不同宿主來源的病毒可以在豬體內(nèi)發(fā)生變異，當(dāng)產(chǎn)生可以結(jié)合人流感病毒受體的病毒時，可能引發(fā)在人群中的流行。因此加強對流感受體特異性的研究可以幫助我們及時掌握病毒的變異狀況，了解病毒的宿主范圍[4]。

雖然近年來，國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種針對流感病毒的診斷技術(shù)，滿足了我國針對流感病毒流行病學(xué)檢測以及防制的迫切需要[5]。但目前仍無有效手段對流感病毒病原的變異和宿主的特異性進行檢測和評估。本實驗通過構(gòu)建含有單一唾液酸受體的紅細胞可以快速檢測流感病毒的受體特異性，進而判斷病毒的宿主嗜性。為評估病毒變異對人類造成的潛在威脅，制定合理有效的公共衛(wèi)生防制策略提供理論依據(jù)和有效手段。

1 材料和方法

1.1 病毒株和細胞 禽源豬流感病毒(SIV)A/swine/Guangzhou/L1/2010(H9N2)、H3和H9亞型AIV標準抗原均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院禽病實驗室保存；AIV A/chicken/Guangdong/383/2008(H5N1)由本實驗室在8日齡病死雞胚中分離；人流感病毒A/PR/8/34(H1N1)由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供；雞紅細胞(RBC)采自健康成齡公雞。

1.2 主要試劑 霍亂弧菌神經(jīng)氨酸酶(Vibrio choleraeneuramindase，VCNA)、唾液酸轉(zhuǎn)移酶底物CMP-唾液酸(CMP-sialic acid)、α2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶(α-2,3-Sialytransferase)與 α2,6 唾液酸轉(zhuǎn)移酶(α-2,6-Sialytransferase)均購自Sigma公司；枸櫞酸-枸櫞酸鈉-磷酸二氫鈉-腺嘌呤-葡萄糖抗凝劑(CPDA)購自廣州齊云生物有限公司；FITC標記的西洋接骨木凝集素(SNA)FITC-SNA(僅與 SAα2,6Gal結(jié)合)和FITC標記的朝鮮槐凝集素(MAA)FITC-MAA(僅與SAα2,3Gal結(jié)合)購自 EY labs公司。

1.3 RBC懸液的制備 用CPDA01抗凝劑潤濕注射器，無菌采集健康雞血液，1500 r/min離心15 min，棄上清液。用pH7.2的PBS重懸雞RBC，洗滌3次，每次1500 r/min離心10 min，棄上清液，利用PBS將洗滌后的雞RBC分別配制成10%和1%的RBC懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RBC表面受體的處理 取100 μL濃度為10%的健康雞RBC加入50 mU VCNA，37℃水浴1 h，每20 min震蕩一次，PBS洗滌3次，2000 r/min離心5 min，重懸后配制成1%的RBC懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 VCNA紅細胞受體的重新標記 取上述制備的VCNA雞RBC 50 μL，加入1.5 mmol/L磷酸胞苷唾液酸。將其分為兩等分，分別加入10 μL(濃度為1 mg/mL)的α-2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶和α-2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶，37℃孵育2 h。PBS洗滌3次，配置成1%的雞RBC懸液。

1.6 流式細胞儀檢測RBC受體 利用細胞計數(shù)儀分別取3×106個正常雞RBC、VCNA處理的雞RBC和α2,3和α2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理的雞RBC，分別與FITC標記的植物凝集素FITC-SNA(30 μg/mL)和FITC-MAA(30 μg/mL)37 ℃作用 30 min，PBS 洗滌3次。利用流式細胞儀進行熒光強度檢測。

1.7 RBC表面受體特異性的檢測 在96孔微量血凝板上分別以H5N1亞型AIV和H1N1亞型人流感病毒檢測正常的雞RBC、VCNA處理的雞RBC和分別通過不同唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理的雞RBC。以此確定不同唾液酸轉(zhuǎn)移酶的標記效果。

1.8 流感病毒受體特異性的檢測 利用已構(gòu)建的含有單一唾液酸受體的RBC對H9N2亞型SIV以及H3和H9亞型AIV標準抗原進行血液凝集試驗，檢測上述流感病毒的受體特異性，并以已知受體類型的病毒作為對照。

2 結(jié) 果

2.1 RBC表面受體的檢測 對正常的RBC、VCNA處理的RBC以及經(jīng)過唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理過的RBC分別進行流式檢測，結(jié)果顯示，正常雞RBC可以與FITC-SNA和FITC-MAA結(jié)合，證明其表面含有SAα2,3Gal和 SAα2,6Gal受體(圖 1A2、A3)；VCNA處理的雞RBC不能夠與FITC-SNA與FITC-MAA結(jié)合，表明神經(jīng)氨酸酶已經(jīng)將RBC表面受體消除(圖1D2、D3)；經(jīng)過 α2,3唾液酸轉(zhuǎn)移酶處理過的雞RBC僅與FITC-MAA結(jié)合，表明其表面只含有單一SAα2,3Gal受體(圖 1C2)；而雞 RBC經(jīng)過 α2,6唾液酸轉(zhuǎn)移酶重新標記后僅與FITC-SNA結(jié)合，表明其只含有 SAα2,6Gal受體(圖 1B3)。

圖1 流氏細胞儀檢測紅細胞表面唾液酸受體的熒光Log值Fig.1 Log Fluorescence intensity on surface of RBCs detected by flow cytometry

2.2 RBC表面受體特異性的驗證 分別利用正常的雞RBC、VCNA處理的雞RBC以及分別標記SAα2,3Gal和 SAα2,6Gal受體的 RBC對 H1N1亞型人流感病毒和H5N1亞型AIV進行檢測。結(jié)果表明，正常紅細胞可以與H5N1亞型AIV和H1N1亞型人流感病毒均發(fā)生凝集反應(yīng)；VCNA處理的雞RBC與兩種病毒均未發(fā)生凝集反應(yīng)；只標記有SAα2,3Gal受體的雞RBC只能夠與AIV結(jié)合，而人流感病毒只能夠與標記有SAα2,6Gal的雞RBC發(fā)生凝集(圖 2)。

2.3 流感病毒受體結(jié)合特性的檢測 利用已構(gòu)建好的含有單一唾液酸受體的RBC對H3和H9亞型AIV標準抗原及H9N2亞型SIV的受體特異性進行檢測，結(jié)果顯示，SIV可以與標記有SAα2，3Gal受體和SAα2,6Gal受體的RBC均發(fā)生凝集反應(yīng)，表明SIV表面含有SAα2,3Gal和SAα2,6Gal這兩種受體。H3和H9亞型AIV標準抗原僅與標記有SAα2,3Gal受體的紅細胞發(fā)生凝集反應(yīng)(圖3)。

圖2 已知受體特異性的流感病毒對含有不同受體類型紅細胞的凝集特性檢測Fig.2 Hemagglutination assay of influenza virus using chicken RBCs with different receptors

圖3 流感病毒受體結(jié)合特異性的檢測結(jié)果Fig 3 Identification of receptor binding specificity of influenza virus

3 討 論

近年來頻繁發(fā)生的動物源流感病毒直接感染人事件提示流感病毒可以通過變異跨越種屬障礙威脅人類身體健康。流感病毒必須通過與宿主細胞表面的唾液酸寡糖鏈結(jié)合，才能進入宿主細胞進行復(fù)制轉(zhuǎn)錄[6]。通過分析流感病毒對不同唾液酸受體的結(jié)合能力，可以幫助我們加深對流感病毒宿主嗜性的理解。2001年，To和Mederios等利用外源凝集素?zé)晒夥诸惙ㄑ芯勘砻麟uRBC表面同時具有SA2,3Gal和SAα2,6Gal唾液酸糖鏈[7]。人們后來發(fā)現(xiàn)VCNA處理后的雞RBC不與流感病毒發(fā)生凝集反應(yīng)[8]。因此本實驗采用糖生物化學(xué)技術(shù)，利用VCNA消除RBC表面受體，然后通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶重新將單一唾液酸受體重新標記到RBC表面。利用構(gòu)建的RBC對流感病毒進行血凝試驗，可以準確判斷流感病毒的受體特異性。

據(jù)報道SNA和MAA可以分別特異性的結(jié)合雞RBC表面的SA2,6Ga與SAα2,3受體，因此本實驗將標記有FITC-SNA和FITC-MAA的RBC進行流式檢測，結(jié)果表明單一唾液酸受體可以被有效的標記到RBC表面[9]。而對流感病毒受體結(jié)合特性檢測試驗結(jié)果表明含有單一唾液酸受體的RBC可以有效區(qū)分人流感病毒和AIV。此外對SIV進行的受體結(jié)合特性檢測表明，SIV可以在豬體內(nèi)發(fā)生變異，獲取感染人類唾液酸受體的能力，具有在人群中引發(fā)流行的潛能，繼而威脅人類身體健康。本實驗所構(gòu)建的檢測方法操作簡單，可以在短時間內(nèi)對流感病毒的受體特異性進行準確、快速的檢測。該檢測方法既可以為及時發(fā)現(xiàn)能夠引起人間大流行的病毒株提供技術(shù)手段，也可以為預(yù)測流感的流行、制定積極有效的公共衛(wèi)生應(yīng)對方案提供充分的科學(xué)依據(jù)。

[1]劉金華.一種鑒定A型流感病毒受體親和特性的方法[P].CN20071176058.1，2008.

[2]鐘耀剛，秦棪楠，孫士生，等.流感病毒識別糖鏈受體分子機制的研究進展[J].Progress Biochem Biophysics，2012，39(7)：605-612.

[3]李海燕，于康震，楊煥亮，等.中國豬源H5N1和H9N2亞型流感病毒的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2004，26(1)：1-6.

[4]Suzuki Y,Ito T,Suzuki T,et al.Sialic acid species as a determinant of the host range of influenza A viruses[J].J Virol,2000,74:11825-11831.

[5]Stone B,Burrows J,Schepetiuk S,et al.Rapid detection and simultaneous subtype differentiation of influenza A viruses by real time PCR[J].J Virol Methods,2004,117:103-112.

[6]Couceiro J N,Paulson J C,Baum L G.Influenza virus strains selectively recognize sialyloligosaccharides on human respiratory epithelium;the role of the host cell in selection of hemagglutinin receptor specificity[J].Virus Res,1993,29:155-165.

[7]Medeiros R,Escriou N,Naffakh N,et al.Hemagglutinin residues of recent human A(H3N2)influenza viruses that contribute to the inability to agglutinate chicken erythrocytes[J].Virology,2001,289:74-85.

[8]Zhang Wei,Shi Yi,Lu Xi-shan,et al.An airborne transmissible avian influenza H5 hemagglutinin seen at the atomic level[J].Science,2013,340:1463-1467.

[9]Ueno K,Hanamure Y,Ohyama M.Differences in terminal carbohydrate structures of sialomucin in the murine nasal cavity[J].Eur Arch Otorhinolaryngol,1994,251:119-122.