張思春，楊凡力，余 樂(lè)，何 彪，涂長(zhǎng)春

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130122)

蝙蝠是地球上僅次于嚙齒類(lèi)的第二大類(lèi)哺乳動(dòng)物。目前發(fā)現(xiàn)的4600個(gè)哺乳動(dòng)物物種中，有942種(約占20%)為蝙蝠[1]。蝙蝠被認(rèn)為是許多新發(fā)人獸共患病病毒如尼帕病毒[2]、亨德拉病毒[3]、SARS冠狀病毒[4]等的自然儲(chǔ)存宿主。在中國(guó)菊頭蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的SARS-樣冠狀病毒(SARS-like coronaviruses，SL-CoVs)引發(fā)人們嘗試在不同的蝙蝠物種中分離SL-CoV病毒。目前從蝙蝠組織中已經(jīng)檢測(cè)到至少66種病毒，但由于缺少蝙蝠細(xì)胞系，利用其它哺乳動(dòng)物的細(xì)胞系來(lái)分離蝙蝠病毒較困難，所以分離出的病毒株較少。

從動(dòng)物組織器官分離到的原代細(xì)胞在體外進(jìn)行有限的增殖后會(huì)進(jìn)入衰老期，稱(chēng)為Hayflick限制。但包括病毒癌基因在內(nèi)的多種因子可以延長(zhǎng)細(xì)胞的生命周期，甚至使細(xì)胞在體外無(wú)限增殖，建立永生化的細(xì)胞系。Crameri等通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)SV40 LT抗原或人端粒酶催化亞基(hTERT)基因進(jìn)入中央狐蝠(Pteropus alecto)的腦、肺、腎等組織細(xì)胞中，建立了幾種永生化的蝙蝠細(xì)胞系[5]。Krahling等轉(zhuǎn)移腺病毒血清5型的E1A基因到北非果蝠(Rousettus aegyptiacus)胎兒細(xì)胞中，建立了R06E細(xì)胞系，并用于馬爾堡病毒的研究[6]。本研究將SV40 LT基因?qū)朐鹛耗I細(xì)胞(Bat fetal kidney cell，BFK)中，建立了能夠在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)的永生化細(xì)胞系。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒株 pBABE-puro-SV40 LT質(zhì)粒由Addgene公司惠贈(zèng)；pVSV-G質(zhì)粒及GP2-293細(xì)胞購(gòu)自Clontech公司；小鼠神經(jīng)瘤N2a細(xì)胞、Marc-145細(xì)胞、Vero-E6細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；蝙蝠西江病毒(XRV)和蝙蝠輪狀病毒RVA/Bat/MSLH14株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 低熔點(diǎn)瓊脂糖、polybrene和嘌呤霉素購(gòu)自Sigma公司；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Roche公司；Prime Script RT reagent kit with gDNA eraser試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；鼠抗SV40 LT抗原單克隆抗體(MAb)購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；驢抗小鼠熒光二抗Alexa Flour 680購(gòu)自Invitrogen公司。

1.3 BFK的分離培養(yǎng) 將捕獲的懷孕母蝙蝠用乙醚麻醉，取出胎兒置入玻璃皿內(nèi)，分離腎臟并剪碎，用冷的DMEM洗滌3次，加入EDTA-胰蛋白酶，37℃水浴30 min；移除上清液，DMEM反復(fù)吹打組織塊，取上清液200×g離心5 min，沉淀重懸于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DEME培養(yǎng)基中，于37℃5%CO2中培養(yǎng)，每2 d～3 d傳代1次。

1.4 蝙蝠種類(lèi)鑒定 首先對(duì)蝙蝠進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，此外提取BFK的基因組DNA，擴(kuò)增其線(xiàn)粒體1140 bp的細(xì)胞色素cyt b基因并測(cè)序，通過(guò)BLAST序列比對(duì)鑒定該蝙蝠的物種。

1.5 永生化蝙蝠胎兒腎細(xì)胞系的建立 培養(yǎng)GP2-293細(xì)胞至80%～90%單層時(shí)，按FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)方法共轉(zhuǎn)染pBABE-puro-SV40 LT和pVSV-g質(zhì)粒，48 h后收集含假病毒顆粒的培養(yǎng)基上清液，過(guò)濾后分裝于凍存管，-80℃保存。將第4代BFK培養(yǎng)于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%匯合時(shí)進(jìn)行假病毒感染，加入終濃度為8 μg/mL的polybrene。感染8 h后更換正常培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h，將細(xì)胞傳至100 mm培養(yǎng)皿中并加入3 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得具有嘌呤霉素抗性的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，并采用已建立的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中LT基因的表達(dá)[7]。提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)SV40 LT基因的表達(dá)，采用裂解液裂解蝙蝠細(xì)胞，進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)印到NC膜上，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中LT抗原表達(dá)。一抗為小鼠抗SV-40 LT MAb，二抗為驢抗小鼠熒光抗體Alexa Flour 680，洗膜后進(jìn)行熒光掃描。

為制備細(xì)胞系，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)行終點(diǎn)稀釋克隆純化，以胰酶消化，計(jì)數(shù)并將之稀釋至1個(gè)細(xì)胞/100 μL培養(yǎng)基，加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔中平均有1個(gè)細(xì)胞，于37℃5%CO2中培養(yǎng)，挑取單細(xì)胞長(zhǎng)出的克隆孔，待長(zhǎng)滿(mǎn)單層后消化，轉(zhuǎn)移到24孔板培養(yǎng)板放大培養(yǎng)，隨后挑取不同克隆進(jìn)行進(jìn)一步放大培養(yǎng)以制備更多的細(xì)胞并凍存。

1.6 軟瓊脂克隆形成試驗(yàn) 將培養(yǎng)皿預(yù)先用0.6%的低熔點(diǎn)瓊脂糖包被。將轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞消化后懸浮于含0.3%的瓊脂糖的完全培養(yǎng)基中，加入包被好的培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)皿中分別含1×104和2×103個(gè)細(xì)胞。于37℃5%CO2條件下培養(yǎng)，7 d后補(bǔ)充含0.3%瓊脂糖的培養(yǎng)基，2周～3周后觀(guān)察有無(wú)克隆生長(zhǎng)。同時(shí)取小鼠神經(jīng)瘤N2a細(xì)胞系作為對(duì)照。

1.7 病毒感染性評(píng)價(jià) 取XRV細(xì)胞培養(yǎng)物，稀釋至104TCID50/mL，分別感染上述建立的BFK細(xì)胞系和Vero-E6細(xì)胞，觀(guān)察細(xì)胞病變(CPE)，待CPE穩(wěn)定后，收集細(xì)胞培養(yǎng)物并反復(fù)凍融，離心后取上清液在Vero-E6細(xì)胞上進(jìn)行病毒TCID50的測(cè)定。同時(shí)將蝙蝠輪狀病毒RVA/Bat/MSLH14株稀釋至107TCID50/mL，分別感染建立的BFK細(xì)胞系和Marc-145細(xì)胞，觀(guān)察CPE。

2 結(jié) 果

2.1 BFK的分離培養(yǎng)與蝙蝠種類(lèi)鑒定 利用倒置相差顯微鏡觀(guān)察原代培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)消化的細(xì)胞團(tuán)塊貼壁后，從其周?chē)屑?xì)胞貼壁生長(zhǎng)，逐漸鋪滿(mǎn)瓶底，細(xì)胞呈不規(guī)則多角形，形成緊密排列的單層。隨著細(xì)胞傳代，形態(tài)變得更加均一，為典型的上皮細(xì)胞形態(tài)(圖1)。通過(guò)提取BFK細(xì)胞基因組DNA，擴(kuò)增長(zhǎng)度為1140 bp的線(xiàn)粒體cyt b基因并測(cè)序，序列比對(duì)分析結(jié)果表明該蝙蝠為東亞水鼠耳蝠(Myotis petax)。

圖1 蝙蝠胎兒原代及永生化細(xì)胞系(100×)Fig.1 Morphology of primary and immortalized BFK cells(100×)

2.2 轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的特征 轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)嘌呤霉素篩選6 d左右，未見(jiàn)細(xì)胞死亡。在傳到33代時(shí)進(jìn)行了單細(xì)胞克隆，獲得3個(gè)單細(xì)胞衍生的細(xì)胞系，分別命名為Mp-Ki01、Mp-Ki02、Mp-Ki03。這 3個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞群體倍增時(shí)間均約在36 h，并且保持上皮細(xì)胞典型的不規(guī)則多角形態(tài)，呈緊密的單層排列(圖1)。由于Mp-Ki03細(xì)胞系的增殖速率更穩(wěn)定，形態(tài)更均一，因此被用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)已培養(yǎng)至第60代。

2.3 SV40LT基因表達(dá)的檢測(cè) SV40 LT轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞后，通過(guò)RT-PCR和western blot進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中均檢測(cè)到SV40 LT基因的表達(dá)(圖2A)，western blot結(jié)果出現(xiàn)特異性條帶，表達(dá)蛋白的大小為94 ku(圖2B)。表明SV40 LT基因在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中已整合并表達(dá)。

圖2 SV40 LT基因表達(dá)檢測(cè)Fig.2 Detection of SV40 LT gene expression

2.4 軟瓊脂克隆形成分析 第33代Mp-Ki細(xì)胞在克隆前進(jìn)行了軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)，結(jié)果顯示培養(yǎng)17 d后細(xì)胞仍呈單細(xì)胞懸浮狀，未形成克隆，而對(duì)照的N2a細(xì)胞則形成了明顯的細(xì)胞團(tuán)，表明Mp-Ki轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞未發(fā)生癌變，仍為正常細(xì)胞，可以用于后續(xù)的單細(xì)胞克隆(圖略)。

2.5 病毒易感性試驗(yàn) 將XRV細(xì)胞培養(yǎng)物感染Mp-Ki03細(xì)胞和Vero-E6細(xì)胞，結(jié)果顯示，XRV可以感染Mp-Ki03并引起典型的CPE，至第60 h時(shí)可見(jiàn)較多細(xì)胞融合，細(xì)胞層出現(xiàn)的空隙更多，增大，而未感染的Mp-Ki03細(xì)胞仍呈單層排列生長(zhǎng)，Vero-E6出現(xiàn)更明顯的CPE(圖3)。收集細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融后測(cè)定毒價(jià)，Mp-Ki03細(xì)胞培養(yǎng)物的TCID50為 104.0TCID50/mL，Vero-E6細(xì)胞的 TCID50為105.125TCID50/mL。

圖3 XRV感染Mp-Ki03細(xì)胞和Vero-E6細(xì)胞Fig.3 CPE on XRV-infected Mp-Ki03 and Vero-E6 cells

以蝙蝠輪狀病毒感染Mp-Ki03細(xì)胞20 h后，細(xì)胞圓縮脫落，部分未脫落細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則并牽出胞漿絲，24 h后細(xì)胞脫落50%。感染該輪狀病毒的Marc-145也出現(xiàn)相似的CPE(圖4)。

圖4 蝙蝠輪狀病毒感染Mp-Ki03細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞的CPEFig.4 CPE on rotavirus-infected Mp-Ki03 and Marc-145 cells

3 討 論

由于蝙蝠攜帶的病毒越來(lái)越多地跨越種間屏障，并在人類(lèi)及其它動(dòng)物中引起嚴(yán)重的疾病，因此亟待建立多種蝙蝠細(xì)胞系用于蝙蝠病毒的分離及病毒與宿主相互作用的研究。本研究在分離培養(yǎng)東亞水鼠耳蝠B(yǎng)FK細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將SV40 LT基因轉(zhuǎn)入BFK，篩選的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞通過(guò)RT-PCR和western blot均檢測(cè)到SV40 LT基因的表達(dá)，經(jīng)單細(xì)胞克隆獲得的一株細(xì)胞系Mp-Ki03已培養(yǎng)至第60代，成為了永生化的蝙蝠胎兒腎細(xì)胞系。

SV40 LT是建立永生化細(xì)胞最簡(jiǎn)單可靠的基因[8]，此外其他用于細(xì)胞永生化的基因還包括人乳頭瘤病毒HPV的E6和E7基因、人5型腺病毒的E1A基因，以及人端粒酶催化亞基(hTERT)等[9]。本研究前期分別利用含hTERT基因的假病毒和含SV40 LT基因的假病毒感染BFK，但只有SV40 LT基因成功篩選到抗性克隆。其原因可能是SV40 LT能夠直接抑制細(xì)胞周期的檢查，使少量的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞繼續(xù)快速增殖，進(jìn)而被篩選出來(lái)。

對(duì)獲得的Mp-Ki03細(xì)胞系進(jìn)行病毒感染性試驗(yàn)分析表明，來(lái)自棕果蝠的呼腸孤病毒XRV和來(lái)自菊頭蝠的輪狀病毒在初代接種時(shí)即可感染該細(xì)胞并引起典型的CPE，表明建立的細(xì)胞系對(duì)蝙蝠病毒具有一定的易感性。但由于未進(jìn)行適應(yīng)性傳代，Mp-Ki03對(duì)2種病毒的敏感性低于分離這2種病毒的細(xì)胞。Mp-Ki03細(xì)胞感染XRV后的病變程度較Vero-E6細(xì)胞弱，病毒滴度也比Vero-E6細(xì)胞的低。同樣，Mp-Ki03細(xì)胞對(duì)輪狀病毒的敏感度也比Marc145細(xì)胞略差。這2種病毒分別在Vero-E6和Marc-145細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)，所以其更適應(yīng)、更敏感。因此，推測(cè)當(dāng)這2種病毒在Mp-Ki03細(xì)胞多次連續(xù)傳代適應(yīng)培養(yǎng)后，該細(xì)胞對(duì)病毒的敏感性可能進(jìn)一步提高。并且推測(cè)Mp-Ki03細(xì)胞系對(duì)其他種類(lèi)蝙蝠的病毒可能也具有較好的敏感性和廣譜適應(yīng)性，可以用于嘗試不同蝙蝠來(lái)源的病毒的分離培養(yǎng)，對(duì)建立其他種類(lèi)蝙蝠的細(xì)胞系具有指導(dǎo)意義。

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