李海玉，陳興鳳，余思穎，劉革力，宋方洲

（重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶 400016）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是中國(guó)南方省份及東南亞地區(qū)比較常見(jiàn)的惡性腫瘤，尤其是我國(guó)廣東、廣西，具有明顯的種族聚集性和地域性。研究表明NPC的發(fā)生發(fā)展是多因素作用的結(jié)果，其中許多重要基因參與其發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，已報(bào)道MMP9、VIM等基因的異常表達(dá)促進(jìn)了鼻咽癌的發(fā)生。因此，研究和鼻咽癌發(fā)生相關(guān)的基因，將有助于進(jìn)一步揭示鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后。

Bmi-1（B-cell-specific moloney murine leukemiavirus insertion site 1，Bmi-1）基因是1991年在鼠淋巴細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的多梳基因（polycomb group genes，PcG）家族的重要成員之一［1］。Bmi-1廣泛表達(dá)于多種腫瘤中并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，例如乳腺癌［2］、前列腺癌［3］、胰腺癌［4］等。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)鼻咽癌中Bmi-1的mRNA及蛋白水平表達(dá)均較高，表明Bmi-1與鼻咽癌進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)［5］。為了進(jìn)一步研究Bmi-1與鼻咽癌侵襲遷移的關(guān)系，采用小干擾RNA技術(shù)沉默鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1中Bmi-1的表達(dá)，觀察沉默Bmi-1表達(dá)后，CNE-1細(xì)胞生物學(xué)行為變化，為探討B(tài)mi-1在鼻咽癌侵襲遷移中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Hyclon公司。RT-PCR試劑盒、qRT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。Total RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司。Opti-MEM、Lipofectamine RNAiMAX購(gòu)自Invitrogen公司。Negative control siRNA、BMI-siRNA-269由上海吉瑪基因公司合成。Bmi-1、β-actin的引物由上海生工生物公司合成。小鼠抗人的Bmi-1單克隆抗體購(gòu)自Upstate公司，小鼠抗人β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自Santa Cruz公司。Matrigel膠購(gòu)自Bio-Rad公司，Transwell小室購(gòu)自Millipore公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) CNE-1細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心保存。采用含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25% 胰酶消化細(xì)胞，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 siRNA的合成及轉(zhuǎn)染 由本課題組前期篩選出的有干擾效果的BMI-siRNA-269，正義鏈：5′-AUGAAGAGAAGGGAUUTT-3′，反義鏈：5′-AAUCCCUUCUCUUCAUTT-3′。陰性對(duì)照 GFP-Si正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUG

ACACGUUCGGAGAATT-3′。干粉 siRNA用 DEPC水稀釋成20μmol·L-1，-20℃保存。轉(zhuǎn)染前24h，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞0.25%胰酶消化，計(jì)數(shù)后每孔按2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%～70%，按Lipofectamine RNAiMAX說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。細(xì)胞分3組：（1）空白組（只加 Lipofectamine RNAiMAX Reagent）；（2）對(duì)照組（GFP-siRNA／Lipofectamine RNAiMAX復(fù)合物）；（3）實(shí)驗(yàn)組（BMI-siRNA269／RNAiMAX復(fù)合物）

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平將轉(zhuǎn)染48 h后的空白組、GFP-Si組、Bmi-1siRNA-269組細(xì)胞提取Total RNA，核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)說(shuō)明書(shū)合成cDNA。用于擴(kuò)增Bmi-1cDNA的上游引物為：5′-GACCACTACTGAATATAAGG-3′，下 游 引 物 為：5′-CATTTGTCAGTCCATCTCTC-3′；β-actin的上游引物為：5-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。cDNA產(chǎn)物 10倍稀釋后以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃300 s（39個(gè)循環(huán)）；反應(yīng)結(jié)束建立溶解曲線。同一實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用2-▲▲ct法計(jì)算。

2.3 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平 siRNA轉(zhuǎn)染72 h后分別收集各組細(xì)胞，按碧云天公司蛋白提取說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg／孔蛋白樣品上樣，經(jīng)12%SDS-PAGE后，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，與一抗（Bmi-1、β-actin）4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min，再分別與相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光。

2.4 Matrigel檢測(cè)CNE-1細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel膠置于4℃過(guò)夜，用無(wú)血清預(yù)冷的RPMI 1640培養(yǎng)基按8∶1稀釋Matrigel膠混勻，每孔60μl均勻鋪在24孔Transwell上室的聚碳酸酯膜上，37℃孵箱1 h。收集轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)后按2×103個(gè)細(xì)胞／孔接種于上室。將小室放于24孔板中，上室加入200μl無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基，下室加800μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦掉上室細(xì)胞，PBS洗3次，800μl甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS沖洗干凈，室溫風(fēng)干。顯微鏡下取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取其平均值，每組重復(fù)3次。

2.5 Transwell檢測(cè)CNE-1細(xì)胞遷移能力 Tranwell實(shí)驗(yàn)不鋪 Matrigel膠，37℃、5%CO2培養(yǎng)12 h取出小室，其余步驟參照侵襲實(shí)驗(yàn)。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的周期 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后胰酶消化收集各組細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，PBS洗滌兩次，最后加入1 ml PBS重懸并轉(zhuǎn)移至1.5 ml的EP管中。加入5μl Annexin-FITC輕搖震蕩混勻，4℃孵育15 min，然后再加入5μl的碘化丙啶4℃孵育15 min，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)分別獨(dú)立重復(fù)3次。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后胰酶消化收集各組細(xì)胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，PBS洗滌兩次，之后加入250μl PBS緩慢吹勻細(xì)胞，再加入750μl預(yù)冷無(wú)水乙醇，4℃固定過(guò)夜。離心后棄上清液，PBS洗滌1次，每個(gè)樣本中加500μl 1×FACS buffer和2.5μl RNaseA混勻室溫孵育15 min，再加入25μl PI，室溫避光孵育15 min，轉(zhuǎn)移至流式檢測(cè)管中，放在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行DNA含量分析。每組實(shí)驗(yàn)分別獨(dú)立重復(fù)3次。

2.8 CCK-8測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖曲線 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以每孔5 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞貼壁后0、24、48、72、96 h檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每孔加入10μl CCK-8試劑，37℃孵育2 h，在酶標(biāo)儀上450 nm測(cè)OD值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料用xˉ±s表示，兩組均數(shù)比較兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 Bmi-1 siRNA在CNE-1細(xì)胞中干擾效率的檢測(cè) 與空白組、對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組Bmi-1基因mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），空白組和陰性對(duì)照組無(wú)明顯差別（Fig 1，2）。說(shuō)明Bmi-1基因被有效沉默。

Fig 1 Bmi-1 mRNA expression detected by real-time fluorescence quantitative PCR

Fig 2 Bmi-1 protein expression detected by Western blot

3.2 抑制Bmi-1基因表達(dá)，CNE-1遷移能力的變化 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后，顯微鏡下計(jì)數(shù)空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)Transwell上室的細(xì)胞數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，與空白組、對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），而空白組、對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。說(shuō)明Bmi-1基因被沉默后，CNE-1細(xì)胞的遷移能力明顯下降（Fig 3）。

3.3 抑制Bmi-1基因表達(dá)，CNE-1侵襲能力的變化 顯微鏡下計(jì)數(shù)空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，與空白組、對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），而空白組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。說(shuō)明Bmi-1基因被沉默后，CNE-1侵襲能力下降（Fig 4）。

Fig 3 Transwell migration assay of CNE-1 infected with siRNAA：Blank group；B：Control group；C：Experimental group（×100）

Fig 4 Matrigel invasion assay of CNE-1 infected with siRNAA：Blank group；B：Control group；C：Experimental group（×100）

3.4 抑制Bmi-1基因表達(dá)后，CNE-1細(xì)胞周期的變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示：空白組和對(duì)照組的G1期細(xì)胞所占比例分別為54.61%和58.03%，S期細(xì)胞所占比例分別為35.29%和33.92%，空白組和對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組G1期及S期細(xì)胞所占比例分別為73.71%和19.00%，與空白組、對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞減少，統(tǒng)計(jì)分析具有明顯差異 （P＜0.05），見(jiàn)Fig 5。

3.5 抑制Bmi-1基因表達(dá)后，CNE-1細(xì)胞凋亡的變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示：空白組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的凋亡率分別為 1.48%、1.17%、1.31%。實(shí)驗(yàn)組與空白組、對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05），見(jiàn) Fig 6。

3.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng) 通過(guò)對(duì)細(xì)胞貼壁后0、24、48、72、96 h檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) Bmi-1基因被沉默后，CNE-1細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制（Fig 7）。

Fig 5 Cell cycle distribution of CNE-1 infected with siRNAA：Blank group；B：Control group；C：Experimental group

Fig 6 Cell apoptosis of MDA-MB-231 infected with siRNA measured by flow cytometryA：Blank group；B：Control group；C：Experimental group

Fig 7 Cell growth curve measured by CCK-8

4 討論

Bmi-1基因是多梳基因家族的成員，參與細(xì)胞的增殖調(diào)控，對(duì)造血干細(xì)胞自我更新及分化潛能起著至關(guān)重要的作用［6-7］。已有研究證實(shí)，Bmi-1的表達(dá)水平與多種腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。那么，Bmi-1是否與鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為相關(guān)呢？為探討這個(gè)問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)采用了前期課題組篩選出的針對(duì)Bmi-1基因有干擾效果的siRNA，研究Bmi-1被沉默后，鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1生物學(xué)行為的變化。采用基質(zhì)膠模型來(lái)研究腫瘤細(xì)胞侵襲遷移，它可以在體外模擬腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)和穿過(guò)基底膜的侵襲遷移過(guò)程。敲除Bmi-1基因后，CNE-1細(xì)胞侵襲、遷移能力明顯下降，細(xì)胞被阻滯在S期，說(shuō)明Bmi-1與鼻咽癌的惡性發(fā)展過(guò)程有密切關(guān)系。

Bmi-1在腫瘤的發(fā)展中起重要作用，它可負(fù)向調(diào)節(jié)ink4a位點(diǎn)，下調(diào)p16Ink4a和p19Arfde的表達(dá)，從而抑制c-myc基因誘導(dǎo)凋亡的作用，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［8-10］。Bmi-1過(guò)表達(dá)可引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transtion，EMT），EMT促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，并靶向作用于腫瘤抑制子PTEN，激活 PI3k／AKT／Snail途徑，抑制 E-cadherin生成，促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展［11-12］。

Bmi-1可能通過(guò)不同的途徑在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)控與鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)。一方面，Bmi-1作為細(xì)胞癌基因，被激活后高表達(dá)于鼻咽癌細(xì)胞中，參與調(diào)控細(xì)胞的分裂。高表達(dá)Bmi-1的細(xì)胞通過(guò)抑制p16INK4a表達(dá)，延長(zhǎng)細(xì)胞的增殖周期，阻止細(xì)胞凋亡［13］。在轉(zhuǎn)基因鼠中，Bmi-1表達(dá)抑制導(dǎo)致其神經(jīng)功能上的缺失，還引起淋巴細(xì)胞的細(xì)胞周期嚴(yán)重停滯，而過(guò)表達(dá)Bmi-1的轉(zhuǎn)基因鼠則引發(fā)了鼠的淋巴瘤［14］。因此，有可能因?yàn)?Bmi-1下調(diào)p16INK4a的表達(dá)而導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞周期延長(zhǎng)，增殖旺盛。另一方面，Bmi-1也可能在蛋白水平直接與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)因子發(fā)生作用，但有關(guān)這方面的文獻(xiàn)極少，有待進(jìn)一步研究。今后的實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)就是找出Bmi-1作用的下游靶基因，探明Bmi-1促進(jìn)鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。總之，本研究說(shuō)明Bmi-1在鼻咽癌的惡性發(fā)展中有重要作用。Bmi-1被沉默后，可以明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1的侵襲、遷移能力。但是，Bmi-1基因在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，以及在侵襲遷移中的分子機(jī)制和信號(hào)通路尚需進(jìn)一步的研究。我們相信本研究將為臨床治療鼻咽癌提供新的策略。

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