戴支凱，楊成芳，陳毅飛，蔣君男，車冠華，覃江克

（1.桂林醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣西桂林 541004；2.廣西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院藥用資源化學(xué)與藥物分子工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林 541004）

呫噸酮（xanthone，氧雜蒽酮）類化合物是以呫噸酮為母體的一類化合物，主要存在于龍膽科和藤黃科植物中，是近代天然產(chǎn)物中的一類重要活性成分。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)早已應(yīng)用含呫噸酮類化合物的植物治療多種疾病［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，呫噸酮類化合物具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、呼吸及胃腸功能、降血壓、抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化、抗血栓形成、抗腫瘤、抗HIV-1和延緩神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病進(jìn)程等活性［2］。腫瘤是威脅人類健康的一類疾病，呫噸酮類化合物的抗腫瘤作用已引起了醫(yī)藥學(xué)界的廣泛關(guān)注［3-5］，但其抗腫瘤應(yīng)用前景有待進(jìn)一步探究［6］，這就需要將呫噸酮類化合物的分離和合成與藥理學(xué)緊密結(jié)合，篩選出具有活性的先導(dǎo)化合物，并采用化學(xué)修飾等手段，使之成為廣譜、高靶向、低毒的抗腫瘤藥物［7］。為此，我們合成了呫噸酮的衍生物5，9-二（2-吡咯烷基乙酰氨基）-7H-吡啶并［4，3-c］呫噸-7-酮［N，N′-（7-oxo-7H-chromeno［3，2-h］quinoline-5，9-diyl）-bis（2-（pyrrolidin-1-yl）acetamide），XP-16］，抗腫瘤篩選顯示，XP-16具有良好的抗腫瘤作用［8］。本研究以人肺癌細(xì)胞株A549為研究對(duì)象，初步探索了XP-16抗腫瘤的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與試劑 人肺癌A549細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）于含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按常規(guī)方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；5氟尿嘧啶（5-FU，上海旭東海普藥業(yè)有限責(zé)任公司）；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)（MTT）、Fura-2／AM、Hoechst 33258、羅丹明 123（R123）和碘化丙啶（PI）（Sigma公司，美國(guó)）；TRIzol Regent、Prime ScriptTMRT reagent kit和引物［18S，F(xiàn)orward：5′-GAACGAGACTCTGGCATGCTAA-3′，Reverse：5′-ACGCCACTTGTCCCTCTAAGAA-3′；金屬硫蛋白 1A（metallothionein 1A，MT-1A），F(xiàn)orward：5′-CTCGAAATGGACCCCAACTG-3′，Reverse：5′-CAGCCCTGGGCACACTTG-3′；Bad，F(xiàn)orward：5′-AGTGACCTTCGCTCCACATC-3′， Reverse： 5′-CACGGATCCTCTTTTTGCAT-3′］由大連寶生物工程有限公司提供；POWER SYBR?GREEN PCR Master Mix（Applied Biosystems公司，美國(guó)）。

1.1.2 儀器設(shè)備 550型酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國(guó)）；DM4000b型熒光顯微鏡（Leica公司，德國(guó)）；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)（Agilent公司，澳大利亞）；TU1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析儀器有限責(zé)任公司）；Mastercycler Gradient Cycler（Eppendorf AG公司，德國(guó)）；iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System（BioRad公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 XP-16對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 A549細(xì)胞接種于3個(gè)96孔板，每孔9 000個(gè)細(xì)胞，分為陰性對(duì)照組（Control，RPMI 1640）、陽(yáng)性對(duì)照組（5-FU，100μmol·L-1，RPMI 1640配制）和5個(gè)10倍梯度的試藥組（0.01～100μmol·L-1，RPMI 1640配制），每組設(shè)4個(gè)平行孔。3個(gè)96孔板分別用于藥物作用24、48和72 h的檢測(cè)。藥物作用結(jié)束前4 h，加入5 g·L-1的MTT。結(jié)束培養(yǎng)后，棄上清，每孔加入150μl DMSO，于酶標(biāo)儀570 nm檢測(cè)各孔的吸光度值（absorbance value，A value），計(jì)算細(xì)胞存活率和XP-16對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制的IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。藥物作用72 h后，小心吸棄上清，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

為進(jìn)一步觀察XP-16對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆的影響，A549細(xì)胞接種于6孔板，每孔100個(gè)細(xì)胞。次日分組加藥，藥物作用24 h后換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10 d，吉姆薩染色，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)各組的細(xì)胞集落數(shù)（每個(gè)集落的細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算 XP-16對(duì) A549細(xì)胞克隆抑制的IC50。

1.2.2 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡 藥物作用A549細(xì)胞24 h后，應(yīng)用終濃度為20 mg·L-1的PI和10 mg·L-1的Hoechst 33258染色。正常細(xì)胞染色質(zhì)呈均一的藍(lán)染；早期凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，呈亮藍(lán)色；晚期凋亡細(xì)胞核碎裂，藍(lán)染，或核裂解后呈紅染。熒光倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，計(jì)算A549細(xì)胞的凋亡百分率。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)鈣（［Ca2+］i）檢測(cè) 激發(fā)波長(zhǎng)分別為340 nm和380 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm測(cè)定Fura 2-AM熒光強(qiáng)度比率（F340，510／F380，510），能間接反映［Ca2+］i的變化［9］。收集 A549細(xì)胞，加入終濃度為5μmol·L-1的 fura 2-AM，37℃避光孵育 30 min。洗去細(xì)胞懸液中殘余的Fura 2-AM，制成5×108·L-1的細(xì)胞懸液，37℃避光20 min。熒光分光光度計(jì)測(cè)定F340，510／F380，510比率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以給藥前的平均比率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，用ˉx±s表示。

1.2.4 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，Δψm）測(cè)定 細(xì)胞負(fù)載R123后，其熒光強(qiáng)度能間接反映線粒體膜去極化程度［10］。A549細(xì)胞中，加入終濃度為500 nmol·L-1的R123，37℃避光負(fù)載30 min。D-Hanks洗3遍，再用 D-Hanks液重懸細(xì)胞至4×108·L-1。熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm）。測(cè)定藥物作用24 h后的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以xˉ±s表示。

1.2.5 Real-time RT-PCR 收集藥物作用24 h后的A549細(xì)胞，采用TRIzol法收集總RNA。經(jīng)氯仿萃取、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌、DEPC水溶解后，測(cè)定RNA的含量，制成50 mg·L-1RNA樣品。RT（37℃，15 min；85℃，5 s）和 PCR（95℃ 10 min；95℃15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)）后，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用xˉ±s表示，應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞體外增殖 XP-16作用A549細(xì)胞72 h后，陰性對(duì)照組細(xì)胞達(dá)到融合，存在少量脫落細(xì)胞。與陰性對(duì)照組比，XP-16作用后的細(xì)胞密度下降，細(xì)胞碎片增多，亦可見(jiàn)貼壁或懸浮的體積縮小的圓形細(xì)胞。MTT檢測(cè)顯示（Fig 1A），隨給藥劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，A549細(xì)胞的存活率逐漸下降。XP-16作用A 549細(xì)胞24、48和72 h的IC50分別為33.4、11.1和1.8μmol·L-1。XP-16作用A549細(xì)胞24 h后，隨XP-16劑量的增加，A549細(xì)胞克隆數(shù)逐漸減少，其中，XP-16的10和100μmol·L-1組的克隆數(shù)明顯降低（Fig 1B），其克隆抑制的IC50為 3.48μmol·L-1。

2.2 Hoechst 33258和 PI染色 熒光染色顯示（Fig 2），正常細(xì)胞染色質(zhì)呈均一的藍(lán)染；早期凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)聚集，呈亮藍(lán)色；晚期凋亡細(xì)胞核碎裂，藍(lán)染，或核裂解后呈紅染。陰性對(duì)照組凋亡細(xì)胞極少。與陰性對(duì)照組比，XP-16作用后的凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞明顯增多。其中，陰性對(duì)照組的凋亡細(xì)胞百分率為（3.6±2.8）%，10、50和100μmol·L-1的XP-16作用后的凋亡細(xì)胞百分率分別為（18.6±2.7）%、（34.4±5.6）%和（41.9±4.7）%，均高于陰性對(duì)照組（P＜0.01）。

2.3 ［Ca2+］i和 Δψm 熒光分光光度計(jì)檢測(cè)（Fig 3A）顯示，A549細(xì)胞負(fù)載 Fura 2／AM后，F(xiàn)340，510／F380，510比值為（2.39±0.16），10、50和 100μmol·L-1的 XP-16作用后的比值分別為（2.03±0.07）、（1.49±0.14）和（1.29±0.05），均低于陰性對(duì)照組（P＜0.01）。R123熒光強(qiáng)度檢測(cè)顯示（Fig 3B），陰性對(duì)照組R123熒光強(qiáng)度為（144.61±0.55）a.u.，10、50和100μmol·L-1的 XP-16作用后的熒光強(qiáng)度分別為（129.56±0.54）a.u.、（123.28±0.60）a.u.和（112.23±0.53）a.u.，均低于陰性對(duì)照組（P＜0.01）。

Fig 1 Effect of XP-16 on growth（A）and colony formation（B）of A549 cells

Fig 2 Hoechst 33258 and PI staining of A549 cells with XP-16 treatment（200×）A：Control；B：XP-16 10μmol·L-1；C：XP-16 50μmol·L-1；D：XP-16 100μmol·L-1

2.4 Bad和MT-1A mRNA的表達(dá) 熒光定量PCR檢測(cè)顯示（Fig 4），10、50和 100μmol·L-1的XP-16作用后，A549細(xì)胞Bad mRNA的表達(dá)分別增加26.1%、32.0%和56.8%，MT-1A mRNA的表達(dá)分別增加30.6%、168.6%和174.8%。

Fig 3 Effect of XP-16 on［Ca2+］i（A）and Δψm（B）of A549 cells**P＜0.01 vs control（0μmol·L-1）

3 討論

呫噸酮類化合物具有良好的抗腫瘤發(fā)展前景［3］。我們合成了呫噸酮衍生物XP-16，具有良好的抗腫瘤前景［8］。本研究顯示，隨XP-16劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，XP-16對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)，XP-16作用A549細(xì)胞24、48和72 h的IC50分別為33.4、11.1和1.8μmol·L-1。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)顯示，10和100μmol·L-1的 XP-16對(duì)A549細(xì)胞克隆的抑制作用明顯，其 IC50為3.48 μmol·L-1。此外，XP-16作用24 h后，A549細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變（核染色質(zhì)聚集、碎裂或溶解）；隨XP-16濃度的增加，凋亡A549細(xì)胞的比率逐漸增大。這些結(jié)果提示，XP-16通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制了A549細(xì)胞增殖。

Ca2+是細(xì)胞內(nèi)的一種信號(hào)分子，具有保護(hù)細(xì)胞和促進(jìn)細(xì)胞死亡的雙重作用［11］。細(xì)胞內(nèi)Ca2+適度升高時(shí)，Ca2+起著抗凋亡作用［12］；但細(xì)胞內(nèi) Ca2+過(guò)度升高時(shí)，Ca2+起著促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［13］。細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和其它細(xì)胞器內(nèi)Ca2+濃度降低時(shí)，可直接或間接引起細(xì)胞凋亡［14］。此外，線粒體功能紊亂也是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的的關(guān)鍵因素之一。線粒體膜通透性的增加可引起線粒體膜電位下降、促凋亡因子釋放（如Bad）、細(xì)胞氧化磷酸化功能障礙，從而激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［15］。Bcl-2家族中的Bad具有促凋亡作用，Bad可與Bcl-xL等相互作用［16］，引起促凋亡蛋白 Bax、Bak等聚集，進(jìn)而促凋亡分子（如cytochrome C）從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致caspase激活和細(xì)胞凋亡［17-18］。本研究結(jié)果顯示，XP-16劑量依賴性地降低了A549細(xì)胞的［Ca2+］i和線粒體膜電位，上調(diào)Bad mRNA的表達(dá)。提示XP-16誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡可能與降低細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和線粒體膜電位、促進(jìn)Bad表達(dá)有關(guān)。

MT是一種富含半胱氨酸的小分子蛋白，與細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)，可作為腫瘤侵襲程度及其預(yù)后的指標(biāo)［19］。另有報(bào)道，誘導(dǎo)MT表達(dá)可起到抗腫瘤作用［20］。MT在腫瘤中的作用可能與腫瘤的來(lái)源、組織學(xué)類型和亞型、腫瘤生長(zhǎng)的不均一性、腫瘤的分化、腫瘤的分期與生長(zhǎng)方式等因素有關(guān)［21］，尚待進(jìn)一步研究［22］。目前，MT-1A與腫瘤的關(guān)系尚不清楚。Lu等［23］研究報(bào)道，MT-1A可通過(guò)抗凋亡和抗氧化作用，保護(hù)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞。我們以往研究報(bào)道，丹參酮IIA具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，能升高A549細(xì)胞［Ca2+］i，下調(diào) A549細(xì)胞 MT-1A表達(dá)［24］。本研究顯示，XP-16作用后，A549細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，［Ca2+］i降低，MT-1A mRNA表達(dá)上調(diào)。我們推斷：［Ca2+］i的變化是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，MT-1A的表達(dá)上調(diào)可能是［Ca2+］i降低的結(jié)果，即MT-1A表達(dá)的變化可能是細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度改變的下游事件，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，XP-16具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，可能與其降低細(xì)胞內(nèi)鈣和線粒體膜電位有關(guān)。MT-1A表達(dá)的上調(diào)可能是［Ca2+］i降低的結(jié)果。

Fig 4 mRNA expression of Bad（A）and MT-1A（B）in A549 cells treated with XP-16*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（0μmol·L-1）

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