魏建勛， 馬文君， 李紅梅

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西延安 716000)

膜聯(lián)蛋白A2對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響

魏建勛， 馬文君， 李紅梅△

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西延安 716000)

目的：研究膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2，ANXA2)對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移和凋亡能力的影響。方法：以HeLa細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建過表達(dá)載體以及ANXA2-siRNA，轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、scrambled組、ANXA2過表達(dá)組及ANXA2-siRNA組。應(yīng)用real-time PCR法檢測(cè)ANXA2 mRNA表達(dá)水平及Western blotting檢測(cè)ANXA2蛋白表達(dá)水平。分別采用MTT法、Boyden小室法和流式細(xì)胞術(shù)觀察ANXA2對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、遷移及凋亡能力的影響。結(jié)果：ANXA2過表達(dá)組可以顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖和遷移;ANXA2-siRNA組明顯抑制HeLa細(xì)胞的增殖和遷移;ANXA2對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡幾乎無影響。結(jié)論：沉默ANXA2對(duì)人宮頸癌細(xì)胞的凋亡無顯著影響，但可顯著抑制其增殖能力和遷移能力。ANXA2可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中具有十分重要的作用，提示它有可能成為宮頸癌治療的分子靶點(diǎn)。

膜聯(lián)蛋白A2;HeLa細(xì)胞;細(xì)胞增殖;細(xì)胞遷移;細(xì)胞凋亡

宮頸癌(cervical cancer)是最常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率在婦女惡性腫瘤中居第二位，僅次于乳腺癌［1］。隨著人們對(duì)宮頸癌認(rèn)識(shí)程度的不斷加深，防癌普查的廣泛開展以及治療方法的不斷改進(jìn)，發(fā)病率和死亡率有所下降，但腫瘤局部未控、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍是死亡的主要原因。目前隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，從基因表達(dá)水平研究宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、診斷及治療已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2，ANXA2)是一種鈣離子介導(dǎo)的磷脂結(jié)合特性的蛋白質(zhì)，屬于膜聯(lián)蛋白家族成員，廣泛分布于胞核、胞漿及細(xì)胞質(zhì)膜外表面［2］。ANXA2作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，與一系列調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的蛋白質(zhì)相互作用而調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)［3］。ANXA2參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移、DNA的合成、細(xì)胞增殖與凋亡等，與腫瘤發(fā)生發(fā)展及惡性程度密切相關(guān)［4］。研究發(fā)現(xiàn)，ANXA2在大多數(shù)人類腫瘤，如腦癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌以及血液腫瘤表達(dá)均上調(diào)［5］，而在食管癌、前列腺癌、鼻咽癌中表達(dá)下調(diào)［6］。ANXA2的持續(xù)激活和異常表達(dá)與腫瘤增殖分化、細(xì)胞凋亡、新血管生成和免疫逃避密切相關(guān)，阻斷ANXA2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，多種腫瘤細(xì)胞均出現(xiàn)增殖抑制、凋亡增加及侵襲力下降等現(xiàn)象［7］。本研究利用ANXA2基因轉(zhuǎn)染和siRNA干擾技術(shù)刺激體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞，觀察ANXA2過表達(dá)和ANXA2-siRNA對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡能力的變化，進(jìn)一步明確ANXA2在宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、凋亡過程中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞 人宮頸癌細(xì)胞株HeLa，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT、DMSO、TBST緩沖液和碘化丙啶(propidium iodide，PI)均購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Forma)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BioTek)，流式細(xì)胞儀(BD)，Bio-Rad iQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀，激光共聚焦顯微鏡(Lavision)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Fermentas)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RNAiso Plus kit、PrimeScript? RT reagent kit、SYBR? Premix Ex TaqTMII kit、限制性內(nèi)切酶Nhe I、BamH I和T4連接酶(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，LipofectamineTMRNAiMAX和抗 ANXA2抗體(Santa Cruz)。

2 方法

2.1 ANXA2基因siRNA序列的設(shè)計(jì)及轉(zhuǎn)染 siRNA片段由上海生工合成。靶向ANXA2的siRNA上游引物5’-GGGUCUGUCAAAGCCUAUAtt-3’，下游引物3’-ttACCCAGACAGUUUCGGAUA-5’。制備終濃度為80 nmol/L的siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，實(shí)驗(yàn)組加入ANXA2-siRNA混合物，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組(control)。將HeLa細(xì)胞以2×105cells/well接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70% ～80%時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基，采用LipofectamineTM2000將ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)ANXA2序列設(shè)計(jì)合成一對(duì)分別位于ANXA2 cDNA序列上、下兩側(cè)的引物，中間包含有完整的ANXA2編碼序列，上游引物5’-TATCGCTAGCCAGCTTCCTTCAAA-3’，含有Nhe I酶切位點(diǎn);下游引物 5’-TGCGGGATCCATTTCTGGACGCTC-3’，含有BamH I酶切位點(diǎn)，引物采用Bioasia公司的自動(dòng)DNA合成儀合成。提取HeLa細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增后經(jīng)Nhe I和BamH I酶切并與質(zhì)粒pIRES2-GFP的酶切回收產(chǎn)物連接。連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂平板篩選挑取陽性克隆，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳觀察基因片段的大小。然后挑選酶切鑒定符合的質(zhì)粒送上海Invitrogen公司進(jìn)一步測(cè)序鑒定。

2.3 RNA的提取與實(shí)時(shí)定量RT-PCR 以Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒要求操作。按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。ANXA2上游引物 5’-GAGGATGGCTCTGTCATTGATT-3’，下 游 引 物 5’-CTGGTAGTCGCCCTTAGTGTCT-3’，檢測(cè)按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性3 min、95℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán);72℃7 min。以ANXA2/β-actin進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Western blotting 將培養(yǎng)的細(xì)胞用0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗滌2次后離心棄上清，加入含全酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液冰浴裂解提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備10%聚丙烯酰胺凝膠，冰浴進(jìn)行電泳，電泳分離后用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后加稀釋好的抗人ANXA2多克隆抗體4℃孵育過夜，次日PBS 1次、TBST 2次洗膜后加入辣根酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育2 h。洗膜后ECL發(fā)光，X光片顯影、定影、掃描儀掃描膠片。以β-actin作為內(nèi)參照。

2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、scramble組、ANXA2過表達(dá)組及ANXA2-siRNA組。細(xì)胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)基，加入無血清培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱孵育24 h。取出培養(yǎng)板，每孔加20 μL MTT，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。小心吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min使紫色結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定各孔A值，記錄結(jié)果。

2.6 細(xì)胞遷移能力測(cè)定 將4組細(xì)胞(每組大約5×105個(gè))分別懸浮在含有0.2%小牛血清的800 μL培養(yǎng)基中，依次接種至Boyden小室上層，培養(yǎng)6 h。收集遷移到濾膜下層的細(xì)胞，用甲醇固定，并通過HE染色來觀察下層細(xì)胞的數(shù)量，最后通過計(jì)算濾膜下層的細(xì)胞數(shù)來評(píng)估其轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)量。

2.7 細(xì)胞凋亡測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞以1.5×105cells/well接種至 6孔板中，培養(yǎng) 24 h，0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5min沉淀細(xì)胞，PBS洗滌2次后1 000 r/min離心沉淀細(xì)胞。將10×binding buffer稀釋至1×binding buffer，每個(gè)樣品加入300 μL 1×binding buffer，再加入5 μL Annexin V-FITC，室溫避光染色30 min。每個(gè)樣品加入5 μL PI，避光染色5 min后，再補(bǔ)加200 μL 1×binding buffer，吹打均勻后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 ANXA2過表達(dá)載體或siRNA轉(zhuǎn)染效果的鑒定

RT-PCR及Western blotting結(jié)果見圖1，與對(duì)照組相比，scramble組HeLa細(xì)胞中ANXA2 mRNA及蛋白表達(dá)水平幾乎無變化，而ANXA2過表達(dá)組mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高，ANXA2-siRNA組mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。

Figure 1.The transfection efficiency of ANXA2 overexpression vector or siRNA.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖1 ANXA2過表達(dá)載體或siRNA的轉(zhuǎn)染效果

2 ANXA2對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

MTT法測(cè)定結(jié)果見圖2，與對(duì)照組和scramble組相比，ANXA2過表達(dá)組可以顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖，ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖受到明顯的抑制(P＜0.05)，而對(duì)照組和scramble組中HeLa細(xì)胞增殖的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示沉默ANXA2能夠抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖。

Figure 2.Effect of ANXA2 on HeLa cell proliferation.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖2 ANXA2對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

3 ANXA2對(duì)HeLa細(xì)胞遷移的影響

對(duì)照組和 scramble組細(xì)胞發(fā)生遷移數(shù)分別為(78.0±5.0)個(gè)和(75.0±4.1)個(gè)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，ANXA2過表達(dá)組細(xì)胞發(fā)生遷移數(shù)為(123.0±4.7)個(gè)，明顯高于對(duì)照組，而ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞發(fā)生遷移數(shù)為(39.0±3.9)個(gè)，明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，見圖3，表明沉默ANXA2能夠抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的遷移能力。

Figure 3.Effect of ANXA2 on HeLa cell migration.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.圖3 ANXA2對(duì)HeLa細(xì)胞遷移的影響

4 ANXA2對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果見圖4，與對(duì)照組和scramble組相比，ANXA2過表達(dá)組和ANXA2-siRNA轉(zhuǎn)染組對(duì)HeLa細(xì)胞的凋亡無顯著影響，表明ANXA2不參與調(diào)控宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡。

討論

Figure 4.Effect of ANXA2 on HeLa cell apoptosis.圖4 ANXA2對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

宮頸癌的發(fā)病與多因素的參與有關(guān)，但是具體發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與各種基因突變及基因表達(dá)紊亂密切相關(guān)［8-9］。而腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及到腫瘤細(xì)胞與宿主之間復(fù)雜的相互作用，多種基因及其產(chǎn)物參與這一過程的調(diào)控。ANXA2在細(xì)胞內(nèi)參與膜形成、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、胞吞、胞吐、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化及凋亡等一系列重要的生命過程。ANXA2在腫瘤中的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)［10-11］。研究表明，上調(diào)ANXA2基因表達(dá)可促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［12］。對(duì)人肝癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，ANXA2干擾siRNA可以抑制人肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲［13］。對(duì)宮頸癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，ANXA2表達(dá)水平低的患者對(duì)新輔助化療敏感性增加，表明ANXA2可能是誘導(dǎo)宮頸癌患者抵抗新輔助化療的一個(gè)重要因子，同時(shí)，宮頸癌患者基質(zhì)細(xì)胞中ANXA2表達(dá)水平高，則生存率降低［14］。但是，關(guān)于ANXA2在宮頸癌HeLa細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚未見報(bào)道。

本研究通過ANXA2干擾siRNA和ANXA2過表達(dá)載體探討了ANXA2對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移和凋亡能力的影響。我們的研究結(jié)果表明，ANXA2對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡基本無影響，沉默ANXA2基因能夠降低HeLa細(xì)胞的增殖、遷移能力;ANXA2過表達(dá)能夠增強(qiáng)HeLa細(xì)胞的增殖、遷移能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，宮頸癌HeLa細(xì)胞與生長(zhǎng)因子ANXA2的高表達(dá)密切相關(guān)，ANXA2可以成為宮頸癌治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。雖然本研究證實(shí)了ANXA2在宮頸癌中發(fā)揮著重要作用，但是確切的信號(hào)途徑尚不清楚，有待于進(jìn)一步探討。

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Effect of annexin A2 on proliferation，migration and apoptosis of human cervical cancer HeLa cells

WEI Jian-xun，MA Wen-jun，LI Hong-mei
(Department of Obstetrics and Gynaecology，Affiliated Hospital of Yanan University，Yanan 716000，China.E-mail:submission029@gmail.com)

AIM:To explore the effect of annexin A2(ANXA2)on the proliferation，migration and apoptosis abilities of human cervical cancer HeLa cells.METHODS:Overexpression vectors and siRNA of ANXA2 were constructed，and then transfected into HeLa cells.The HeLa cells were divided into 4 groups:control group，scramble group，ANXA2 overexpression group and ANXA2-siRNA group.The expression of ANXA2 at mRNA and protein levels was examined by real-time PCR and Western blotting.MTT assay，Boyden chamber and flow cytometry were used to determine the effect of ANXA2 on the proliferation，migration and apoptosis abilities of the HeLa cells.RESULTS:The proliferation and migration of HeLa cells were obviously promoted by ANXA2 overexpression.The proliferation and migration of HeLa cells were remarkably inhibited by the transfection of ANXA2-siRNA.ANXA2 had no effect on apoptosis of HeLa cells.CONCLUSION:Silencing of ANXA2 effectively inhibits the proliferation and migration of cervical cancer cells，but has little effect on apoptosis.ANXA2 may play a pivotal role in the occurrence and development of cervical cancer，and may be used as a molecular target for the treatment of cervical cancer.

Annexin A2;HeLa cells;Cell proliferation;Cell migration;Apoptosis

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.029

1000-4718(2014)03-0547-04

2013-10-31

2014-01-13

△通信作者Tel:0911-2881213;E-mail:submission029@gmail.com