黃 煒， 徐 玲， 周雪琴， 徐 勇△

(1瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院內分泌科，四川瀘州 646000;2成都市新都區(qū)人民醫(yī)院內分泌科，四川成都 610500)

SUMO化修飾對高糖誘導的大鼠腎系膜細胞IKKγ/NF-κB信號的影響*

黃 煒1，2， 徐 玲1， 周雪琴1， 徐 勇1△

(1瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院內分泌科，四川瀘州 646000;2成都市新都區(qū)人民醫(yī)院內分泌科，四川成都 610500)

目的：探討小泛素相關修飾物(SUMO)化修飾對高糖誘導的腎系膜細胞IκB激酶γ(IKKγ)/NF-κB信號的影響。方法：體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細胞，設正常對照組、高糖干預組和滲透壓對照組:用免疫印跡和RT-PCR法檢測各組細胞SUMO1、SUMO2/3、IKKγ和NF-κB p65的表達;用免疫共沉淀檢測SUMO與IKKγ蛋白間的相互作用。結果：高糖呈濃度和時間依賴性上調系膜細胞SUMO和NF-κB p65表達(均P＜0.01)。各組細胞IKKγ的蛋白與mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(均P＜0.05);高糖組SUMO與IKKγ蛋白間的相互作用減弱(均P＜0.01)。結論：高糖影響IKKγ的SUMO化修飾，可能參與了高糖誘導的腎系膜細胞NF-κB信號激活的調控。

小泛素相關修飾物;IκB激酶γ;NF-κB;糖尿病腎病

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病特有而嚴重的微血管并發(fā)癥，近年來的研究表明炎癥是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，核因子κB (NF-κB)是目前公認的介導炎癥信號的主要信號通路并且在DN發(fā)病過程中扮演著重要的角色。IκB激酶(IκB kinase，IKK)γ又名NEMO(NF-κB essential modulator)，分子量為48 kD，是IKK復合物的調節(jié)亞基，介導了NF-κB信號經典途徑的激活。小泛素相關修飾物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)修飾是與泛素化修飾類似的蛋白質翻譯后修飾，參與了NF-κB、TGF-β等信號通路的調控。SUMO化修飾是否通過影響NF-κB信號參與DN的發(fā)病尚未見文獻報道。為此，本研究觀察不同濃度高糖刺激后大鼠腎系膜細胞SUMO(SUMO1、SUMO2/3)與IKKγ的表達，并探討在高糖誘導下腎系膜細胞SUMO與IKKγ蛋白間的相互作用，為進一步研究高糖條件下SUMO化修飾對NF-κB信號調控的分子機制打下基礎。

材料和方法

1 主要材料

大鼠腎小球系膜細胞(HBZY-1，購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心);兔抗大鼠 SUMO1單克隆抗體(Abcam);兔抗大鼠 SUMO2/3多克隆抗體(Millipore);免抗大鼠IKKγ多克隆抗體(Santa Cruz);兔抗大鼠NF-κB p65單克隆抗體(CST);小鼠抗大鼠GAPDH抗體(碧云天生物)

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)和實驗分組 HBZY-1細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的低糖DMEM中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。對數生長期細胞用于實驗，隨機分設(1)正常對照組(NC組):使用低糖(含葡萄糖5.6 mmol/L)培養(yǎng)基;(2)高糖干預組(HG1、HG2和HG3組):培養(yǎng)基含葡萄糖濃度分別為10、20和30 mmol/ L;(3)滲透壓對照組(OP組):培養(yǎng)基含5.6 mmol/L葡萄糖和24.4 mmol/L甘露醇。各組分別作用6 h、12 h和24 h后收獲細胞。

2.2 免疫印跡(Western blotting)法 取細胞加蛋白抽提液，加樣品電泳，轉膜，封閉，分別加兔抗大鼠IKKγ多克隆抗體(1∶800)、兔抗大鼠SUMO1單克隆抗體(1∶800)、兔抗大鼠 SUMO2/3多克隆抗體(1∶600)、兔抗大鼠 NF-κB p65 單克隆抗體(1∶1 000)和小鼠抗大鼠 GAPDH單克隆抗體(1∶2 000)，4℃過夜，PBST洗膜后分別用HRP標記的羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgGⅡ抗孵育1 h，化學發(fā)光顯影。以IKKγ、SUMO、NF-κB p65與GAPDH蛋白條帶平均吸光度值之比表示蛋白含量。

2.3 免疫共沉淀(co-immunoprecipitation) 將細胞隨機分為:正常對照組(NC)、20 mmol/L高糖組(HG2)、滲透壓對照組(OP)和正常IgG陰性對照組(IgG)，分別在含上述不同干預因素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。加入含蛋白酶體抑制劑的IP裂解液，定量加入兔抗大鼠IKKγ多克隆抗體、正常大鼠IgG抗體(IgG組)，4℃輪轉搖晃充分孵育。將蛋白-抗體復合物移入離心柱并加入含protein A/G瓊脂糖，密封輪轉孵育1 h;離心洗脫瓊脂糖，將免疫沉淀產物煮沸變性后行 Western blotting分析，用兔抗大鼠SUMO1單克隆抗體(1∶800)和兔抗大鼠SUMO2/3多克隆抗體(1∶600)孵育檢測SUMO蛋白與IKKγ蛋白間相互作用。

2.4 RT-PCR 總RNA提取試劑盒提取各組腎系膜細胞總RNA，反轉錄成cDNA于PCR反應管中擴增，SUMO1上游引物5’-TATGGACAGGACAGCAG-3’，下游引物5’-CCATTCCCAGTTCTTTTG-3’，擴增產物為170 bp。SUMO2/3上游引物5’-GACGAGAAACCCAAGGA-3’，下游引物5’-CTGCCGTTCACAATAGG-3’，擴增產物為140 bp;內參照GAPDH上游引物5’-CCTCAAGATTGTCAGCAAT-3’，下游引物5’-CCATCCACAGTCTTCTGAGT-3’，擴增產物為114 bp。IKKγ上游引物5’-CAGCCTATCACCACCTCTT-3’，下游引物5’-GCACTTGGGACAACAGA-3’，擴增30個循環(huán)后，上樣2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)成像，以IKKγ、SUMO1和SUMO2/3的灰度值除以GAPDH的灰度值分別得到各檢測指標的相對灰度值。

3 統(tǒng)計學處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，各組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 高糖上調系膜細胞SUMO表達

與NC組比較，高糖作用6 h、12 h和24 h后，各組系膜細胞SUMO1、SUMO2/3蛋白和mRNA表達均增強(均P＜0.05)，見圖1A;其中30 mmol/L葡萄糖作用24 h后系膜細胞SUMO1、SUMO2/3蛋白和mRNA表達增強達峰值。不同濃度高糖干預系膜細胞24 h后，與NC組比較，SUMO1、SUMO2/3蛋白和mRNA表達量隨糖濃度增加，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)，見圖1B;SUMO1、SUMO2/3蛋白和mRNA表達量與OP組比較，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)。以上結果提示高糖呈時間和濃度依賴性上調系膜細胞SUMO蛋白與mRNA表達。

2 高糖對系膜細胞IKKγ表達無明顯影響

與NC組比較，30 mmol/L葡萄糖作用6 h、12 h和24 h后，IKKγ蛋白和mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義，作用時間延長至48 h和72 h后差異仍無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)，見圖2A;各組間差異亦無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)。與NC組比較，不同濃度高糖作用24 h后，IKKγ蛋白和mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)，見圖2B。以上結果提示高糖刺激對系膜細胞IKKγ表達無明顯影響。

Figure 1.The expression of SUMO1 and SUMO2/3 at protein and mRNA levels in rat mesangial cells after 30 mmol/L glucose challenge for different time periods(A)and at different glucose concentrations(B)detected by Western boltting and RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group;#P＜0.05 vs HG2 or HG3 group.圖1 Western boltting和RT-PCR檢測不同濃度和不同時間高糖作用系膜細胞后SUMO1、SUMO2/3蛋白及mRNA的表達

3 高糖減弱系膜細胞IKKγ的SUMO化修飾

免疫共沉淀結果顯示，用抗IKKγ抗體免疫沉淀IKKγ-未知蛋白復合物后，免疫印跡法電泳、轉膜、抗SUMO1和SUMO2/3抗體孵育，化學發(fā)光示在約80 kD處出現明顯的SUMO1-IKKγ(圖3A)和SUMO2/ 3-IKKγ(圖3B)結合條帶，在17 kD(SUMO1和SUMO2/3)處出現明顯的游離SUMO條帶;同時，正常IgG對照組在相應蛋白分子位置未顯現蛋白條帶，提示免疫共沉淀結果可靠。進一步比較NC組、HG2組、OP組及IgG對照組蛋白分子表達量，與NC組比較，HG2組與OP組蛋白分子表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05);HG2組與OP組間比較差異無統(tǒng)計學意義(均P＞0.05)，見圖3C、D。以上結果提示高糖可能誘導SUMO與IKKγ蛋白間的相互作用減弱。

4 高糖激活NF-κB信號

與NC組比較，高糖干預24 h后，隨糖濃度提高，NF-κB p65蛋白表達逐步增加，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.05)，見圖4，提示高糖呈濃度依賴性增強腎系膜細胞NF-κB p65蛋白表達。

Figure 2.The protein and mRNA expression of IKKγ in rat mesangial cells after 30 mmol/L glucose challenge for different time periods(A)and at different glucose concentrations(B)detected by Western boltting and RT-PCR.Mean±SD.n=3.圖2 Western boltting和RT-PCR檢測不同濃度和不同時間高糖作用系膜細胞后IKKγ蛋白及mRNA的表達

Figure 3.SUMOylation of IKKγ in rat mesangial cells after high-glucose challenge detected by co-immunoprecipitation.A:SUMO1 interacted with IKKγ;B:SUMO2/3 interacted with IKKγ;C:interaction between SUMO1 and IKKγ in different groups;D: interaction between SUMO2/3 and IKKγ in different groups.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group.圖3 免疫共沉淀檢測高糖作用系膜細胞后對IKKγ SUMO化修飾的影響

Figure 4.The expression of NF-κB p65 protein in rat mesangial cells after high-glucose challenge at different glucose concentrations detected by Western blotting.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group.圖4 Western blotting檢測不同濃度高糖作用系膜細胞后NF-κB p65蛋白的表達

討論

與泛素化介導的蛋白降解不同，SUMO化修飾是通過蛋白-蛋白相互作用而賦予靶蛋白新的生物特性，在加強蛋白質的穩(wěn)定性、核質轉運、信號轉導、轉錄調控等過程中都發(fā)揮了廣泛而重要的作用［1］。本研究發(fā)現，正常糖濃度組大鼠系膜細胞SUMO表達被抑制在很低的水平，伴隨著糖濃度的提高，SUMO表達逐漸增強。本研究結果與大鼠低氧性肺動脈高壓形成過程中SUMO表達增強的結果類似［2］，于是推測SUMO蛋白可能作為一種細胞應激蛋白，參與多種細胞信號轉導蛋白的翻譯后修飾，從多種層面動態(tài)地影響細胞信號轉導及相關靶基因的轉錄和翻譯，可能參與包括糖尿病腎病在內的多種疾病的病理生理改變。

IKK是一個多亞基催化酶，是NF-κB信號與上游刺激因子(LPS、胰島素等)的聯系樞紐，包括催化亞基IKKα、IKKβ以及調節(jié)亞基IKKγ?；罨腎KK使IκBα蛋白2個絲氨酸殘基(S32、S36)磷酸化，繼而發(fā)生泛素化降解，NF-κB活化轉位入核，啟動炎癥相關基因(如IL-6)的轉錄和翻譯［3］。

雖然IKK復合物的催化作用依賴于2個催化亞基，但是近年的研究表明［4］，調節(jié)亞基IKKγ結構的完整性對IKK復合物的活性及下游NF-κB的激活起到重要作用，如單獨過表達IKKγ二聚體和IKK相互作用基序都能激活IKK，但是在全長的IKKγ缺失時這2種過表達狀態(tài)對IKK的激活都比較弱;并且，IKKγ涉及的蛋白間相互作用可能影響多種信號通路功能的發(fā)揮。本研究表明，高糖刺激對腎系膜細胞IKKγ mRNA與蛋白表達無明顯影響，推測IKKγ表達有相對穩(wěn)定性，其本身不參與催化NF-κB信號的活化。

作為調節(jié)亞基，IKKγ在NF-κB途徑中被視為一種支架蛋白，可能與多種分子相互作用，如在TNF刺激下，IKKγ對接頭蛋白RIP1的募集對于IKK和NF-κB活性起到重要作用。最近的研究顯示，IKKγ可被SUMO修飾，修飾位點在K277和K309這2個賴氨酸殘基上，參與了DNA損傷誘導的NF-κB信號活化［5］。另有研究發(fā)現，SUMO化酶PIASy可誘導并促進SUMO與IKKγ共價結合，活化IKK復合物，使NF-κB信號放大，抗氧化劑能逆轉DNA損傷誘導的IKKγ SUMO化修飾［6］。到目前為止只發(fā)現了IKKγ特異性的SUMO1修飾，而SUMO2/3能否修飾IKKγ迄今未見報道。本研究證明，正常條件下SUMO1和SUMO2/3均可修飾IKKγ，高糖刺激減弱SUMO1和SUMO2/3與IKKγ的相互作用(即SUMO化)，推測這可能是高糖影響IKK下游信號轉導途徑，激活NF-κB信號，參與糖尿病腎病發(fā)病的又一可能機制。

綜上所述，本研究結果表明SUMO化修飾可能參與了高糖誘導的腎系膜細胞IKKγ/NF-κB信號的激活，其作用機制可能與高糖減弱SUMO與IKKγ的相互作用、改變IKK復合物的信號轉導途徑及上調NF-κB p65表達有關。

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Effects of SUMOylation on IKKγ/NF-κB signaling in cultured rat glomerular mesangial cells treated with high glucose

HUANG Wei1，2，XU Ling1，ZHOU Xue-qin1，XU Yong1
(1Department of Endocrinology，Affiliated Hospital of Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China;2Department of Endocrinology，People’s Hospital of Xindu District，Chengdu 610500，China.E-mail:xywyll@aliyun.com)

AIM:To investigate the effects of SUMOylation on IκB kinase γ(IKKγ)/NF-κB signaling in cultured rat glomerular mesangial cells(GMCs)treated with high glucose.METHODS:Cultured HBZY-1 rat GMCs were divided into normal glucose group and high glucose groups，and mannitol was used for osmotic control.The expression of SUMO1，SUMO2/3，IKKγ and NF-κB p65 was measured by Western blotting and RT-PCR.Interaction between SUMO and IKKγ was detected by co-immunoprecipitation.RESULTS:Compared with normal glucose group，the expression of SUMO and NF-κB p65 was increased in high glucose groups in a dose-and time-dependent manner.The expression of IKKγ was not changed by high glucose.The SUMOylation of IKKγ in high glucose groups was significantly decreased as compared with normal glucose group.CONCLUSION:High glucose obviously changes the interaction between SUMO and IKKγ in cultured rat mesangial cells，which may be involved in the activation of NF-κB by taking a special influence on the SUMOylation of IKKγ/NF-κB signaling molecules.

Small ubiquitin-related modifier;I-kappa B kinase gamma;NF-kappa B;Diabetic nephropathies

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.027

1000-4718(2014)03-0538-05

2013-10-25

2013-01-15

四川省教育廳科研項目(No.11ZB223)

△通訊作者Tel:0830-3161546;E-mail:xywyll@aliyun.com