曾志剛， 徐麗姝， 關(guān)麗嫦， 高慧亭

(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院消化科，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州 510080)

利拉魯肽對非酒精性脂肪肝大鼠脂聯(lián)素及胰島素抵抗的影響*

曾志剛， 徐麗姝△， 關(guān)麗嫦， 高慧亭

(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院消化科，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東廣州 510080)

目的：觀察利拉魯肽(Lira)對非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠血清和肝組織脂聯(lián)素(ADP)及胰島素抵抗的影響。方法：雄性SD大鼠30只，隨機分為3組，分別予普通飲食(ND組)10只、高脂飲食(HFD組)10只和高脂飲食加利拉魯肽腹腔注射(Lira組)10只。高脂飲食12周建立大鼠NAFLD模型，建模成功后Lira組予利拉魯肽腹腔注射治療4周。16周末處死各組大鼠，生物化學(xué)法檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)及總膽固醇(TC)，分光光度計測定游離脂肪酸(FFAs)，酶聯(lián)免疫吸附法測定胰島素和ADP。結(jié)果：與HFD組比較，Lira組大鼠體質(zhì)量、肝指數(shù)、胰島素抵抗指數(shù)、血清TG、TC、ALT、FBG及肝勻漿TG、TC、FFAs顯著下降(均P＜0.05)，血清及肝組織ADP明顯升高(P＜0.05)，肝臟脂肪變性程度明顯減少至恢復(fù)正常(P＜0.05)，肝組織ADP含量與肝臟FFAs含量呈負相關(guān)。結(jié)論：利拉魯肽改善胰島素抵抗和肝臟脂肪變的可能機制之一與其升高血清及肝組織脂聯(lián)素水平有關(guān)。

利拉魯肽;胰高血糖素樣肽1;非酒精性脂肪性肝病;脂聯(lián)素;胰島素抵抗

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種常見的慢性肝病，在世界范圍內(nèi)廣泛分布。目前認為NAFLD是與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷［1］。NAFLD的發(fā)生、發(fā)展涉及到遺傳、環(huán)境和生活方式等多種因素，與肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗、糖尿病等有關(guān)，被認為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)［2-4］。脂聯(lián)素(adiponectin，ADP)是脂肪細胞分泌的一種特異性蛋白，有研究認為ADP具有改善糖脂代謝及抗炎等作用，在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［5］。胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)類似物利拉魯肽(liraglutide，Lira)具有降低體重及改善脂質(zhì)代謝紊亂等作用，已經(jīng)越來越多地被應(yīng)用于NAFLD的治療研究中［6-7］。Lira的上述作用是否與ADP的影響有關(guān)，目前報道較少，本研究通過高脂飲食(high-fat diet，HFD)建立NAFLD大鼠模型，探討Lira對NAFLD大鼠胰島素抵抗、血清和肝組織ADP含量及肝臟脂質(zhì)和游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs)含量的影響，并探討ADP與血清甘油三酯(triglyceride，TG)及肝臟FFAs的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠30只，體重(140± 10)g，購自中山醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑 GLP-1類似物L(fēng)ira購自丹麥諾和諾德公司;血清胰島素和ADP試劑盒為國產(chǎn)ELISA試劑盒;FFAs、甘油三酯及膽固醇試劑盒均購自南京建成生物技術(shù)研究所。

2 方法

2.1 動物模型的建立 6周齡雄性SD大鼠30只，普通飼料喂養(yǎng)1周后隨機抽取10只為正常飲食(normal diet，ND)組，繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，余20只為制模組給予高脂飼料(其中普通飼料88%、豬油10%、膽固醇2%)至第14周末，隨機處死正常飼養(yǎng)組1只和制模組1只，經(jīng)檢測制模組肝指數(shù)、血脂、肝轉(zhuǎn)氨酶等顯著增高，進行肝組織切片HE染色肝細胞明顯脂肪變性確認制備模型成功。制模組剩余19只隨機分為2組:HFD組9只，繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng);Lira組10只繼續(xù)予高脂飲食同時Lira 0.6 mg· kg-1·d-1腹腔注射。18周末予水合氯醛溶液腹腔麻醉處死所有大鼠，下腔靜脈采血分離血清，取部分肝組織于液氮速凍后低溫保存，另取部分肝組織行病理檢查。

2.2 肝指數(shù) 實驗結(jié)束時稱體重和肝濕質(zhì)量，肝濕重/體重×100%即為計算肝指數(shù)。

2.3 血清中指標的測定 將下腔靜脈留取的血液3 000 r/min離心10 min，取上層血清，通過全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、空腹血糖(fas-ting blood glucose，F(xiàn)BG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)和TG，空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)和ADP采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis assessment of insulin resistance，HOMA-IR)=FBG×FINS/22.5。

2.4 肝勻漿指標的測定 精確稱取相同部位的肝組織200 mg，置于1.8 mL勻漿介質(zhì)，冰浴條件下2 000 r/min勻漿3 min，制備成10%的肝組織勻漿。肝組織ADP通過酶聯(lián)免疫吸附法測定，肝組織TG和TC使用生物化學(xué)法檢測，分光光度計測定肝勻漿FFAs。

2.5 病理學(xué)檢查 部分肝組織以40%中性甲醛溶液固定，制備石蠟切片，采用HE染色;同時取部分冰凍肝組織制備冰凍切片，采用油紅O染色。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析。采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析測量指標的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 大鼠一般情況、體質(zhì)量及肝指數(shù)的變化

與ND組比較，HFD組大鼠性情溫順，不喜動，毛色黃膩，Lira組與ND組相似。HFD組與ND組相比，體重和肝指數(shù)均顯著增高(P＜0.05);與HFD組相比，Lira組體重和肝指數(shù)均顯著下降(P＜0.05); Lira組與ND組相比，體重?zé)o顯著差異(P＞0.05)，肝指數(shù)增高(P＜0.05)，見表1。

表1 大鼠體重、肝指數(shù)及血清各項指標的檢測結(jié)果Table 1.Results of body weight，liver index，and serum indicators in rats(Mean±SD)

2 血清及肝勻漿生物化學(xué)指標的檢測

HFD組與ND組相比，大鼠血清TG、TC、ALT、FBS及肝勻漿TG、TC、FFAs均明顯升高(P＜0.05)，血清和肝組織ADP明顯降低(P＜0.05)，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義。Lira組與HFD組相比，血清TG、TC、ALT、FBS及肝勻漿TG、TC、FFAs均明顯降低(P＜0.05)，血清和肝組織ADP明顯升高(P＜0.05)，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義。Lira組與ND組相比，各項指標均無顯著差異(P＞0.05)，見表1、2。

3 胰島素抵抗指數(shù)

HFD組的HOMA-IR＞2.69，ND組和Lira組的HOMA-IR＜2.69，根據(jù)2010年美國糖尿病協(xié)會糖尿病指南的標準:HOMA-IR＞2.69為有胰島素抵抗的標準，ND組和Lira組未產(chǎn)生胰島素抵抗，胰島素敏感性提高，與HFD組比較，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 大鼠HOMA-IR及肝勻漿各項指標的檢測結(jié)果Table 2.Results of liver homogenate indicators in rats(Mean±SD)

4 病理學(xué)檢查結(jié)果

光鏡下顯示，ND組肝細胞排列整齊，肝小葉規(guī)則，細胞中央有大而圓的核，細胞質(zhì)均勻。HFD組大鼠肝細胞腫脹，體積較正常明顯增大，出現(xiàn)脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的脂滴空泡，以大泡性脂肪滴為主，匯管區(qū)有以單核、淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，部分出現(xiàn)點狀壞死和灶狀壞死，已進展為非酒精性脂肪肝炎階段。Lira組肝細胞明顯較高脂組肝細胞體積縮小，未見脂肪變性，肝小葉內(nèi)未見炎癥，見圖1、2。

5 Lira對血清及肝組織脂聯(lián)素的影響

HFD組與ND組相比，大鼠血清及肝勻漿ADP明顯降低(P＜0.05)。Lira干預(yù)后，血清及肝組織ADP明顯升高(P＜0.05)，見圖3。

6 血清ADP與血清TG及肝組織ADP與肝組織FFAs的關(guān)聯(lián)性

血清 ADP與血清 TG具有負相關(guān)性(r= -0.54，P＜0.05);肝組織ADP含量與肝組織FFAs含量具有負相關(guān)性(r=-0.45，P＜0.05)。

Figure 1.Histopathological observation of rat liver tissues(HE staining，×400).A:ND group;B:HFD group;C:Lira group.圖1 HE染色觀察各組大鼠肝組織病理學(xué)變化

Figure 2.Histopathological observation of rat liver tissues(Oil red O staining，×400).A:ND group;B:HFD group;C:Lira group.圖2 油紅O染色觀察各組大鼠肝組織病理學(xué)變化

Figure 3.The effect of liraglutide(Lira)on adiponectin(ADP).A:the level of ADP in serum;B:the level of ADP in liver homogenates.*P＜0.05 vs ND group;△P＜0.05 vs HFD group.圖3 Lira對脂聯(lián)素的影響

討論

NAFLD是一種無過量飲酒史、以肝實質(zhì)細胞脂肪變性和脂肪儲積為特征的臨床病理綜合征。NAFLD的發(fā)病機制至今尚未完全闡明。較為成熟的是“二次打擊”學(xué)說。第一次打擊是引起NAFLD的首發(fā)原因，包括各種原因?qū)е碌闹|(zhì)代謝紊亂，使過多的脂質(zhì)在肝細胞內(nèi)沉積，而以胰島素抵抗和氧應(yīng)激脂質(zhì)過氧化為核心的二次打擊導(dǎo)致脂肪變的肝臟發(fā)生炎癥壞死和纖維化［1］。

GLP-1是一種葡萄糖依賴性腸促胰素，可通過增加脂肪酸氧化，改善肝臟的脂肪病變及氧應(yīng)激，對非酒精性脂肪肝起到明顯的改善作用［8］。GLP-1可改善肝臟脂肪變性，并不單純依賴于減輕體重所致整體代謝參數(shù)的改善［9］。GLP-1可能通過增加肝臟載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)的表達或上調(diào)ADP水平，顯著降低TG、TC水平，減少低密度脂蛋白的合成［10］。Lira是 GLP-1類似物，與天然 GLP-1有97%的同源性，具備GLP-1全部生理作用［11］。本研究模型組大鼠肝組織FFAs、血清TG及TC顯著升高，ADP與FFAs和TG呈明顯負相關(guān)，提示ADP降低導(dǎo)致TG和FFAs升高可能是NAFLD形成的機制之一。經(jīng)Lira治療后能使NAFLD大鼠脂質(zhì)代謝紊亂明顯改善。

NAFLD已被證實與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［12-13］。胰島素抵抗引起NAFLD的主要原因是脂代謝紊亂和高胰島素血癥，導(dǎo)致FFAs增多，增多的FFAs又可通過抑制胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而加重IR［14-15］。同時大量的FFAs在線粒體內(nèi)被氧化，產(chǎn)生過多的活性氧簇(reactive oxide species，ROS)，當(dāng)肝細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生及其作用超過抗氧化系統(tǒng)清除能力時便產(chǎn)生氧化應(yīng)激［16］。Lira可改善β細胞功能，降低體質(zhì)量和低血糖發(fā)生率［11，17］。但有關(guān)其對胰島素敏感性及其機制的研究較少。本研究高脂組FFAs、FBG和HOMA-IR明顯上升，肝組織ADP含量與肝組織 FFAs含量呈顯著負相關(guān)。Lira干預(yù)后FFAs、FBG和HOMA-IR均顯著改善并恢復(fù)至正常飼養(yǎng)組水平，說明NAFLD大鼠經(jīng)Lira處理后，糖脂代謝明顯改善，有效逆轉(zhuǎn)了IR。

ADP是脂肪細胞分泌的一種特異性蛋白，大量的動物和人體實驗發(fā)現(xiàn)ADP與肥胖、IR、冠心病及NAFLD 密切相關(guān)［18-19］。LI等［20］測量了 60例NAFLD患者及60例正常患者的血清ADP含量和HOMA-IR，說明低ADP與IR呈負相關(guān)，是引起IR的獨立影響因素。本研究顯示模型組大鼠血清及肝組織ADP明顯低于對照組，HOMA-IR明顯上升，說明低ADP可能在NAFLD的發(fā)生中起一定的作用，模型組大鼠經(jīng)Lira處理后，血清及肝組織ADP明顯增高，HOMA-IR明顯上升，提示Lira改善IR可能與升高血清及肝組織ADP有關(guān)。

本研究在前期發(fā)現(xiàn)GLP-1類似物L(fēng)ira具有抗炎、改善氧應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化、減輕體重及抑制攝食等作用的基礎(chǔ)上，進一步從體內(nèi)代謝角度對其在NAFLD的機制上進行研究。結(jié)果表明Lira處理4周后，大鼠血漿及肝組織ADP水平升高的同時，糖脂代謝明顯改善，IR明顯降低，因此，我們推測Lira改善NAFLD胰島素抵抗和肝臟脂肪變的可能機制之一與其升高血清及肝組織ADP水平有關(guān)。

［1］Tessari P，Coracina A，Cosma A，et al.Hepatic lipid metabolism and non-alcoholic fatty liver disease［J］.Nutr Metab Cardiovasc Dis，2009，19(4):291-302.

［2］Tarantino G，F(xiàn)inelli C.What about non-alcoholic fatty liver disease as a new criterion to define metabolic syndrome?［J］.World J Gastroenterol，2013，19(22): 3375-3384.

［3］林妙霞，李澤楷，羅敏琪，等.非酒精性脂肪性肝病與代謝綜合征的關(guān)系研究［J］.中國病理生理雜志，2010，26(12):2465-2466.

［4］李 新，袁 莉，李 進，等.長期高脂喂養(yǎng)大鼠胰島功能改變與胰島炎癥反應(yīng)有關(guān)［J］.中國病理生理雜志，2009，25(5):949-954.

［5］Mendez-Sanchez N，Chavez-Tapia NC，Villa AR，et al.Adiponectin as a protective factor in hepatic steatosis［J］.World J Gastroenterol，2005，11(12):1737-1741.

［6］Nauck M，F(xiàn)rid A，Hermansen K，et al.Long-term efficacy and safety comparison of liraglutide，glimepiride and placebo，all in combination with metformin in type 2 diabetes:2-year results from the LEAD-2 study［J］.Diabetes Obes Metab，2013，15(3):204-212.

［7］Mells JE，F(xiàn)u PP，Sharma S，et al.Glp-1 analog，liraglutide，ameliorates hepatic steatosis and cardiac hypertrophy in C57BL/6J mice fed a Western diet［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012，302(2):G225-G235.

［8］Svegliati-Baroni G，Saccomanno S，Rychlicki C，et al.Glucagon-like peptide-1 receptor activation stimulates hepatic lipid oxidation and restores hepatic signalling alteration induced by a high-fat diet in nonalcoholic steatohepatitis［J］.Liver Int，2011，31(9):1285-1297.

［9］Samson SL，Bajaj M.Potential of incretin-based therapies for non-alcoholic fatty liver disease［J］.J Diabetes Complications，2013，27(4):401-406.

［10］李龍輝，李 伶，楊剛毅，等.利拉魯肽對低脂聯(lián)素血癥小鼠膽固醇代謝相關(guān)基因的影響［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2011，27(7):599-603.

［11］Wajcberg E，Amarah A.Liraglutide in the management of type 2 diabetes［J］.Drug Des Devel Ther，2010，4:279-290.

［12］ Polyzos SA，Kountouras J，Zavos C.Nonalcoholic fatty liver disease:the pathogenetic roles of insulin resistance and adipocytokines［J］.Curr Mol Med，2009，9(3): 299-314.

［13］李蘭芳，郭 玉，唐國濤，等.高脂飲食導(dǎo)致大鼠肝臟胰島素抵抗的作用機制研究［J］.中國病理生理雜志，2011，27(2):310-314.

［14］周 鑫，韓德五，李素紅，等.非酒精性脂肪性肝病在代謝綜合征相關(guān)的2型糖尿病發(fā)病中的作用［J］.中國病理生理雜志，2011，27(7):1352-1359.

［15］陳曉路.非酒精性脂肪肝發(fā)病機制研究進展［J］.人民軍醫(yī)，2010，53(2):147-148.

［16］Bjornsson E，Angulo P.Non-alcoholic fatty liver disease［J］.Scand J Gastroenterol，2007，42(9):1023-1030.

［17］楊文英.人GLP-1類似物利拉魯肽的最新研究進展［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2010，26(9):841-844.

［18］Polyzos SA，Toulis KA，Goulis DG，et al.Serum total adiponectin in nonalcoholic fatty liver disease:a systematic review and meta-analysis［J］.Metabolism，2011，60(3): 313-326.

［19］Sheng T，Yang K.Adiponectin and its association with insulin resistance and type 2 diabetes［J］.J Genet Genomics，2008，35(6):321-326.

［20］Li YL，Yang M，Meng XD，et al.The relationship of leptin and adiponectin with insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2010，18(6):459-462.

Effects of liraglutide on adiponectin and insulin resistance in rats with non-alcoholic fatty liver disease

ZENG Zhi-gang，XU Li-shu，GUAN Li-chang，GAO Hui-ting
(Department of Gastroenterology，Guangdong Institute of Geriatrics，Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangdong General Hospital，Guangzhou 510080，China.E-mail:xulishu70@163.com)

AIM:To investigate the effects of glucagon-like peptide 1 analog，liraglutide，on adiponectin and insulin resistance in the rats with diet-induced non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD).METHODS:Male rats were randomly divided into 3 groups:normal diet(ND)group(n=10)，high-fat diet(HFD)group(n=10)，and HFD with intraperitoneal injection of liraglutide group(n=10，first 12 weeks with HFD，later 4 weeks with liraglutide).All treatments continued for 16 weeks，and then the rats were killed ethically and the blood samples and liver tissues were collected.The levels of alanine aminotransferase(ALT)，fasting blood glucose(FBG)，total cholesterol(TC)and triglyceride (TG)were detected by a biochemical automatic analyzer.The levels of free fatty acids(FFAs)，fasting insulin(FINS) and adiponectin were measured by RIA and ELISA.RESULTS:Compared with HFD group，the body weight，liver index，homeostasis assessment-insulin resistance(HOMA-IR)，the serum levels of TG，TC，ALT and FBG，and the liver levels of TG，TC and FFAs in the rats in liraglutide group were apparently lower，the degree of hepatic steatosis and inflammatory activity significantly decreased(P＜0.05)，and the level of adiponectin in the serum and liver homogenate increased obviously(P＜0.05).The level of adiponectin in the liver homogenate was negatively correlated with the levels of FFAs in the liver homogenate.CONCLUSION:Liraglutide is beneficial for NAFLD rats to improve insulin resistance and reduce hepatic steatosis by increasing the level of adiponectin in the serum and liver tissues.

Liraglutide;Glucagon-like peptide 1;Non-alcoholic fatty liver disease;Adiponectin;Insulin resistance

R575.5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.026

1000-4718(2014)03-0533-05

2013-10-08

2013-12-30

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No.10151008008000003;No.S2012010010953)

△通訊作者Tel:020-83827812;E-mail:xulishu70@163.com