袁靜 付娟娟 陳薇 方慧琴 叢林

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，安徽合肥 230022）

宮頸處脫落滋養(yǎng)細(xì)胞用于孕早期產(chǎn)前診斷的初步研究

袁靜 付娟娟 陳薇 方慧琴 叢林*

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，安徽合肥 230022）

目的探討使用差速貼壁法富集和純化經(jīng)宮頸采集的脫落滋養(yǎng)細(xì)胞在早孕期產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法采用細(xì)胞刷法收集100例孕婦人工流產(chǎn)前由宮頸處取得的脫落滋養(yǎng)細(xì)胞，隨機(jī)分為兩組，一組采用差速貼壁法富集細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，另一組為對(duì)照組，采用直接培養(yǎng)，比較兩組最終的細(xì)胞總量及滋養(yǎng)細(xì)胞所占比率，采用FISH方法對(duì)兩組標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)并分析結(jié)果。對(duì)人流后的絨毛采用染色體核型分析判斷性別。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總量、滋養(yǎng)細(xì)胞所占比率均優(yōu)于對(duì)照組，F(xiàn)ISH檢測(cè)結(jié)果中實(shí)驗(yàn)組45例檢驗(yàn)成功并與絨毛檢測(cè)結(jié)果相符，對(duì)照組29例檢驗(yàn)成功并與絨毛檢測(cè)結(jié)果相符。結(jié)論經(jīng)宮頸獲取胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞為孕早期無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷提供了一個(gè)可能途徑，利用差速貼壁法可以富集并純化滋養(yǎng)細(xì)胞，更利于用FISH行后續(xù)的產(chǎn)前診斷。

脫落細(xì)胞；產(chǎn)前診斷；早期妊娠；CK-7；熒光原位雜交；差速貼壁

產(chǎn)前診斷是降低出生缺陷、提高人口素質(zhì)的重要手段之一，目前臨床上產(chǎn)前診斷的主要手段是通過(guò)羊膜腔穿刺術(shù)或者臍靜脈穿刺術(shù)獲取胎兒標(biāo)本后進(jìn)行染色體核型分析［1，2］。這種方法操作有創(chuàng)、分析時(shí)間長(zhǎng)，而且診斷時(shí)間限制在孕中晚期，孕婦的接受度低且不利于臨床處理，所以尋找一種早期，無(wú)創(chuàng)而且快速的產(chǎn)前診斷方法成為了國(guó)內(nèi)外的研究目標(biāo)［3，4］。1971年Shettles［5］報(bào)道胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞可以從胎盤脫落至宮頸管，并以此成功辨別胎兒性別后，宮頸管處胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞用于產(chǎn)前診斷就被關(guān)注，只是宮頸處取材滋養(yǎng)細(xì)胞雖然能夠獲得，但是一來(lái)滋養(yǎng)細(xì)胞絕對(duì)量少，二來(lái)滋養(yǎng)細(xì)胞所占的比例小，往往混雜著其他大量的母體細(xì)胞［6］。所以，富集和純化宮頸處的胎兒滋養(yǎng)細(xì)胞是一個(gè)需要解決的問(wèn)題，本研究采用差速貼壁法為富集純化滋養(yǎng)細(xì)胞做出初步的探索。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及分組 選取早孕并要求終止妊娠的100名婦女，實(shí)驗(yàn)組妊娠婦女符合以下條件：①要求終止妊娠；②超聲確定為宮內(nèi)妊娠，測(cè)量胚芽頭臀長(zhǎng)并合并末次月經(jīng)確診為孕8～10周；③禁性生活5天以上；④婦科檢查可排除生殖器官炎癥；⑤無(wú)陰道流血等先兆流產(chǎn)癥狀。應(yīng)用細(xì)胞刷無(wú)菌取得的宮頸脫落細(xì)胞，100名婦女隨機(jī)分為兩組，一組采用差速貼壁法富集細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組；另一組采用直接培養(yǎng)為對(duì)照組，無(wú)菌取得所有孕婦的絨毛組織，留待常規(guī)方法細(xì)胞培養(yǎng)染色體核型分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要用品及試劑 一次性細(xì)胞刷（南京微創(chuàng)公司，套管直徑2 mm）、無(wú)菌15 ml離心管、低速離心機(jī)、膠原酶B（美國(guó)Sigma）、4%多聚甲醛、蘇木素-伊紅染料、多聚賴氨酸（北京中杉）、1%曲拉通-100、小鼠抗人細(xì)胞角蛋白7（CK-7）單克隆抗體（北京中杉）、過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（SP）染色試劑盒（北京中杉）、DAB顯色液（北京中杉）、6孔培養(yǎng)板、Amnio MAXTM-Ⅱ-BM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）、胰酶（美國(guó)Sigma）、秋水仙素（美國(guó)Sigma）、小牛血清、紅細(xì)胞裂解液。

1.2.2 經(jīng)宮頸取樣方法 婦女取膀胱截石位，常規(guī)消毒外陰鋪巾，暴露并消毒陰道和宮頸外口，用無(wú)菌干紗布擦凈宮頸外口處粘液。

細(xì)胞刷法使用套管刷伸入宮頸，伸入時(shí)毛刷未伸出塑料軟管，當(dāng)套管刷頭達(dá)到但未超過(guò)宮頸內(nèi)口時(shí)，向前推動(dòng)手柄1 cm，將毛刷伸出使得毛刷一部分剛過(guò)宮頸內(nèi)口處，轉(zhuǎn)動(dòng)2圈后，拉動(dòng)手柄將毛刷退入套管中再取出，移至3 mlPBS液的無(wú)菌試管充分涮洗。

1.2.3 樣本處理及細(xì)胞差速貼壁 將收集到的細(xì)胞懸液放置在無(wú)菌的培養(yǎng)皿中，在倒置顯微鏡下觀察以排除精子的污染。重新將液體移入無(wú)菌試管中，1500 rpm離心5分鐘，沉淀細(xì)胞及黏液，小心棄上清。若倒置顯微鏡下見紅細(xì)胞較多（達(dá)到107個(gè)／L）或離心后紅細(xì)胞占標(biāo)本量的一半以上，可以加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，室溫下放置2～3分鐘后1500 rpm離心5分鐘，棄上清。加入1250 u／ml的膠原酶B 2 ml，放入溫箱中15分鐘，1500 rpm離心5分鐘，棄上清，用2 ml培養(yǎng)液（Amnio MAXTM-Ⅱ-BM，Gibco）重懸細(xì)胞，移入6孔板中。在37℃的CO2培養(yǎng)箱中分別在放置1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)后，將原孔中（a孔）的上懸液移入另一空孔（b孔）中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 目前尚無(wú)公認(rèn)的對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞高度敏感的特異性標(biāo)志物，從文獻(xiàn)報(bào)道中篩選出一種對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞識(shí)別率較高的單克隆抗體，即抗CK-7作為一抗進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鏡下觀察CK-7表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞。

1.2.5 絨毛組織培養(yǎng)及染色體核型分析 將絨毛組織置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用含有雙抗的PBS液沖洗2遍。用眼科剪剪取分支好的幾只，用剪刀充分剪碎似糊狀，加入1 ml 0.25%胰酶和1ml 1250 u／ml膠原酶，混勻后移入15 ml無(wú)菌離心管中。放在37℃培養(yǎng)箱中15分鐘，取出后立即加入1 ml小牛血清終止消化。1500 rpm離心7分鐘，棄上清，加入5 ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并移入25 cm2的培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶放入37℃的5%CO2培養(yǎng)箱。收獲細(xì)胞時(shí)加20μg／ml秋水仙素10 ul，3小時(shí)后用細(xì)胞刮刀收獲細(xì)胞。將細(xì)胞懸液移入普通離心管中，離心10分鐘（2000 rpm），去上清。加入預(yù)熱37℃的0.075M KCl 8 ml，反復(fù)吹打沉淀物，水浴后加入新鮮配制的固定液（甲醇∶冰乙酸＝3∶1）2 ml后混勻，靜置5分鐘后，2000 rpm離心10分鐘，棄上清。重復(fù)固定2次（每次使用固定液8 ml）各30分鐘。1小時(shí)后，2000 rpm離心10分鐘，棄上清。常規(guī)滴片、顯帶、染統(tǒng)計(jì)學(xué)處理色及鏡下分析。每例標(biāo)本核型計(jì)數(shù)不少于30個(gè)，分析3個(gè)核型，異常核型計(jì)數(shù)加倍。

2 結(jié) 果

2.1 差速貼壁培養(yǎng)后細(xì)胞的情況 采用細(xì)胞刷法采集100名早孕婦女的宮頸分泌物中均有脫落滋養(yǎng)細(xì)胞。

2.1.1 實(shí)驗(yàn)組通過(guò)差速貼壁培養(yǎng)6天后，培養(yǎng)成功例數(shù)是47例，對(duì)照組48例培養(yǎng)成功。

2.1.2 培養(yǎng)后倒置顯微鏡下觀察，Ⅰb孔中以成纖維細(xì)胞為主，細(xì)胞大多呈梭狀，胞漿透明，胞核明顯。細(xì)胞排列成放射狀或漩渦狀（見圖1）。Ⅱb孔中滋養(yǎng)細(xì)胞相對(duì)較多，有時(shí)可見滋養(yǎng)細(xì)胞融合成團(tuán)狀，其間混有少量成纖維細(xì)胞（見圖2）。Ⅲb孔中的細(xì)胞細(xì)胞量相對(duì)較少（圖3）。培養(yǎng)后的細(xì)胞收集后，3組b孔的細(xì)胞用CK-7行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，玻片上陽(yáng)性細(xì)胞的比例不同，Ⅱb孔中的陽(yáng)性細(xì)胞率相對(duì)較高（圖4、5、6）。

圖1 Ⅰb孔中細(xì)胞

圖2 Ⅱb孔中細(xì)胞

2.2 FISH實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 應(yīng)用于產(chǎn)前診斷的國(guó)產(chǎn)探針現(xiàn)有兩組：CSP18／CSP X／CSP Y為一組，染色體數(shù)目正常的胎兒顯示為兩個(gè)藍(lán)點(diǎn)／（女孩為兩個(gè)綠點(diǎn)，男孩為一個(gè)綠點(diǎn)一個(gè)紅點(diǎn)）（見圖7、8）；GLP13／ GLP 21為一組，染色體數(shù)目正常的胎兒顯示為兩個(gè)綠點(diǎn)／兩個(gè)紅點(diǎn)（圖9）。

圖3 Ⅲb孔中細(xì)胞

圖4 Ⅰb孔中細(xì)胞

圖5 Ⅱb孔中細(xì)胞

圖6 Ⅲb孔中細(xì)胞

行FISH檢測(cè)，結(jié)果顯示標(biāo)本和探針雜交良好，鏡下觀察見背景暗，細(xì)胞形態(tài)飽滿，包膜完整清晰，熒光信號(hào)明亮清晰，100例均雜交成功，實(shí)驗(yàn)組45例檢驗(yàn)成功并與絨毛檢測(cè)結(jié)果相符，2例不符；對(duì)照組29例檢驗(yàn)成功并與絨毛檢測(cè)結(jié)果相符，19例不符。13、18和21號(hào)染色體的數(shù)目均正常。

圖7 男胎的18／X／Y的FISH圖片

圖8 女胎的18／X／Y的FISH圖片

圖9 13／21的FISH圖片

3 討 論

使用無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的方法采集到的標(biāo)本中?；煊心阁w細(xì)胞，而且收獲陽(yáng)性細(xì)胞率和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)一般不太高，考慮到即使使用了高靈敏度的分子生物學(xué)方法，也不能確保診斷結(jié)果的正確性［7］。本實(shí)驗(yàn)中使用細(xì)胞刷經(jīng)宮頸采集的標(biāo)本中除了脫落的滋養(yǎng)細(xì)胞外，往往混有母體的血細(xì)胞、宮頸的上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。目前純化滋養(yǎng)細(xì)胞的方法有流式細(xì)胞儀分選法、免疫磁珠分選法、密度梯度離心法，主要是通過(guò)滋養(yǎng)細(xì)胞表面表達(dá)的較特異性的抗原或細(xì)胞體積及密度不同而將其分離出來(lái)。但往往獲取的細(xì)胞量較少，且費(fèi)用較高。差速貼壁法是純化和富集細(xì)胞的一種方法。這種方法已經(jīng)成功運(yùn)用在嗅神經(jīng)鞘細(xì)胞、脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞等細(xì)胞的研究中［1，2］。我們將這種方法用于脫落滋養(yǎng)細(xì)胞的富集和純化，一方面可以去除懸浮細(xì)胞，另一方面盡可能地去除成纖維細(xì)胞、宮頸上皮細(xì)胞對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的影響，獲得純度較高的滋養(yǎng)細(xì)胞，這些含有胎兒全部信息的滋養(yǎng)細(xì)胞可以采用任何技術(shù)來(lái)檢測(cè)，以用于產(chǎn)前診斷。

利用FISH技術(shù)快速分析羊水細(xì)胞以獲取胎兒相關(guān)染色體信息目前在國(guó)外已被廣泛采用［3，11］。Lau等［4］對(duì)1996～2004年1351個(gè)絨毛標(biāo)本進(jìn)行FISH檢測(cè)，結(jié)果與傳統(tǒng)染色體核型分析一致率為94%。已有研究顯示，F(xiàn)ISH用于產(chǎn)前診斷檢測(cè)的敏感度和特異度均較高［5，14］。所以本實(shí)驗(yàn)在純化和富集滋養(yǎng)細(xì)胞后，考慮用FISH在對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，一來(lái)檢測(cè)速度快［15］，二來(lái)本研究目的探討宮頸處滋養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)差速貼壁后純化細(xì)胞的效果，F(xiàn)ISH檢測(cè)性別可以作為純化效果的指標(biāo)。本研究?jī)山M病例均有標(biāo)本FISH檢測(cè)結(jié)果與絨毛染色體核型分析不符，其中實(shí)驗(yàn)組僅2例不符，而對(duì)照組有19例不符，這說(shuō)明差速貼壁法富集和純化細(xì)胞還是有一定作用的，會(huì)出現(xiàn)不相符的情況，可能是來(lái)自母體污染，也有可能是FISH技術(shù)本身與絨毛核型分析結(jié)果的差異造成，這有待于進(jìn)一步的研究。

總之，差速貼壁法能夠有效的富集和純化細(xì)胞，但是為了確保后續(xù)診斷的可靠性，需要多尋找一些鑒別母兒細(xì)胞的方法，并盡量簡(jiǎn)單可行，從而使得早孕期產(chǎn)前診斷的可靠性和實(shí)用性會(huì)越來(lái)高。

［1］覃東瓊、尼建平.超聲引導(dǎo)羊膜腔穿刺術(shù)和臍靜脈穿刺術(shù)產(chǎn)前診斷206例分析［J］.中國(guó)誤診學(xué)雜志，2009，24：66-69.

［2］Alfirevic Z，Sundberg K，Brigham S.Amniocentesis and chorionic villus sampling for prenatal diagnosis［J］.Database EBM Reviews-Cochrane Cochrane Database Syst，2007，（02）：CD003252.

［3］Imudia AN，Suzuki Y，Kilburn BA.Retrieval of trophoblast cells from the cervical canal for prediction of abnormal pregnancy：a pilot study［J］.Human Reproduction，2009，（09）：2086-2092.

［4］Bulmer JN，Cioni R，Bussani C.HLA-G positive trophoblastic cells in transcervical samples and their isolation and analysis by laser microdissection and QF-PCR［J］.Prenat Diagn，2003，（01）：34.

［5］Shettles LB.Use of the Y chromosome in prenatal sex determination［J］.Nature，1971，230（5288）：52-53.

［6］高玉連，崔滿華.孕婦生殖道滋養(yǎng)細(xì)胞的檢測(cè)［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2001，（03）：172.

［7］付娟娟、叢林、袁靜，等.孕早期經(jīng)宮頸采集脫落滋養(yǎng)細(xì)胞的研究［J／CD］.中國(guó)產(chǎn)前診斷雜志（電子版），2013，5（1）：3-6.

［8］戴景興，楊林林，曲戎梅，等.差速貼壁法分離培養(yǎng)脂肪源性充質(zhì)干細(xì)胞［J］.中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志.2007，25（3）：313-316.

［9］田鋒，姜曙祥，賀西京，等.經(jīng)改良的取材和差速貼壁法培養(yǎng)純化嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志.2009，25（12）：1189-1191.

［10］Arab S，Chitayat D，Gardner HA，et al.Mosaicism for a small marker chromosome resulting from a familiar Robertsonian translocation（21；22）［J］.Clin Genet，1999，56（2）362-366.

［11］Ulmer R，Pfeiffer RA，Kollert A，et al.Diagnosis of aneuploidy with fluorescence in situ hybridization（FISH）；value in pregnancies with increased risk for chromosome aberrations［J］.Z Geburtshilfe Neonatol，2000，204（1）：1-7.

［12］Lau Tze Kin，Leung Tak Yeung，F(xiàn)ung Tak Yuen，et al Outcome of 1355 consecutive transabdominal chorionic villus samplings in 1351 patients［J］.Chin Med J（Engl），2005 118（20）：1675-1681.

［13］Lee J，Stanley JR，Vaz SA，et al.Down syndrome with pure partial trisomy 21q22 due to a paternal insertion（4；21）uncovered by uncultured amniotic fluid interphase FISH［J］Am J Med Genet A，2005，132（2）：206-208.

［14］Braha E，Martiniuc V，Panzaru M，et al.Prenatal diagnosis of gonosomal anomalies：limitations of the FISH method and genetic counseling difficulties in 15 cases［J］.Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi.2013 Apr-Jun；117（2）：450-456.

［15］Sheth F，Andrieux J，Ewers E，et al.Characterization of sSMC by FISH and molecular techniques［J］.Eur J Med Genet，2011，54（3）：247-255.

ObjectiveTo explore the application value of cast-off trophoblast cells collected from the cervix enriched and purified through the differential adhesion method in the first trimester prenatal diagnosis.MethodThe cast-off trophoblast cells，collected with cytobrushes from the cervixes of 100 cases of pregnant women before induced abortion，were divided into two groups at random：one is the experimental group with cells enriched through the differential adhesion method；the other one is the control group cultivated directly.The final amounts of cells and the ratios of trophoblast cells in both groups were compared，the FISH method was applied to inspect both samples and analyze the results and the chromosomal karyotype analysis was performed on the villi after induced abortion to identify the sex.ResultsThe total amount of cells and the ratio of trophoblast cells in the experimental group were both superior to those in the control group.In the FISH inspection，45 cases in the experimental group were successfully inspected and consistent with the villus inspection，while in the control group only 29 cases were successful and consistent.ConclusionsThe collection of fetal trophoblast cells from cervix provides a feasible approach for the first trimester non-invasive prenatal diagnosis.The differential adhesion method can be applied to enrich and purify the trophoblast cells and benefit the follow-up diagnosis with the FISH method.

cast-off cells；prenatal diagnosis，early pregnancy；CK-7；fluorescence in situ hybridization；differential cohesion

R394.2

A

2014-08-06）

編輯：宋文穎

10.13470／j.cnki.cjpd.2014.04.002

安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（08010302181）

*通訊作者：叢林，E-mail：conglin1957＠163.com