符雪蓮，王軍臣，韓 揚(yáng)，史 陽

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院病理科，上海 200120)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生是多因素、多步驟、多基因參與的復(fù)雜過程［1］。α-甲酰基-輔酶A消旋酶(alpha-methylacyl-coenzyme A racemase，AMACR/P504s)最早發(fā)現(xiàn)是診斷前列腺癌的分子標(biāo)志物［2］。采用多瘤組織芯片免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)［3］，AMACR不僅在前列腺癌中高表達(dá)，在腎細(xì)胞癌肝癌中也有表達(dá)，AMACR在肝細(xì)胞癌中的陽性率為81%。肝硬化是HCC發(fā)生的高危病理因素，RAS基因信號參與了肝硬化肝細(xì)胞異型增生癌變過程中肝酶變化和細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)機(jī)制［4］。為了研究AMACR和RAS在HCC發(fā)生中作用，本研究采用免疫熒光雙標(biāo)記的方法研究了HCC及其癌旁異型增生肝細(xì)胞中Ki-67的表達(dá)，及其分別與AMACR和RAS的原位定位關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例的選擇和組織芯片制作

采自2010至2012年東方醫(yī)院肝臟手術(shù)切除病例，全部均經(jīng)4%中性甲醛固定，石蠟包埋。共收集和分組如下:HCC組織90例，癌旁肝組織90例，另取正常肝組織20例對照。制作組織芯片，組織芯直徑0.2 cm。制作組織芯片切片，厚度為4 μm。

1.2 免疫熒光雙標(biāo)記試劑

選購抗AMACRA單克隆抗體(克隆號P504s，小鼠單抗，DAKO公司產(chǎn)品)，RAS單克隆抗體(克隆號D1712，小鼠單抗，Abnova公司產(chǎn)品)，Ki-67單克隆抗體(克隆號 RB9043-PO，兔單抗，Thermo公司產(chǎn)品);采用簡潔免疫熒光標(biāo)記，二抗抗小鼠 IgG(H+L)，F(xiàn)ab'片段(Alexa Fluor@555 Conjugat)，紅色熒光，抗兔 IgG(H+L)，F(xiàn)ab'片段(Alexa Fluor@555 Conjugat)，綠色熒光。按照說明書推薦的條件和我室常規(guī)的步驟進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)反應(yīng)。

1.3 免疫熒光檢測癌與癌旁肝異型增生肝細(xì)胞Ki-67、RAS和AMACR的表達(dá)

分別采用免疫熒光雙標(biāo)記在組織芯片上檢測HCC與癌旁肝異型增生肝細(xì)胞Ki-67和AMACR的表達(dá)，以及Ki-67和RAS的表達(dá)。隨機(jī)完整切片驗證實驗結(jié)果。免疫熒光組織化學(xué)操作方法按照說明書推薦的程序進(jìn)行，并按本室以往的工作流程稍加改進(jìn)。反應(yīng)完畢后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，定位陽性細(xì)胞，每份樣本固定位點(diǎn)分別拍攝單色照片，然后利用設(shè)備設(shè)置的程序自動合成照片，分析相互的表達(dá)定位。Ki-67定位于細(xì)胞核，AMACR為胞漿著色，RAS為膜漿陽性，陽性細(xì)胞數(shù)＜5%視為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)5% ～25%定義為灶性陽性，25%～50%定義為片狀陽性，＞50%且彌散分布定義為彌漫陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。率的比較采用χ2檢驗及精確χ2檢驗;AMACR和RAS表達(dá)的關(guān)系用Sperman相關(guān)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCC組織與癌旁肝組織中AMACR、RAS及Ki-67表達(dá)的比較分析

AMACR在HCC中的表達(dá)率高于正常對照組，在HCC組織中AMACR的表達(dá)多呈彌漫性分布，而在癌旁肝細(xì)胞中則呈現(xiàn)小灶性陽性和片狀陽性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。RAS在HCC中表達(dá)的陽性率高于癌旁肝組織，30%(27例)呈彌漫性高表達(dá)。統(tǒng)計學(xué)顯示，AMACR和RAS彌漫性表達(dá)的分布特征呈正相關(guān)(r=0.416，P＜0.05)，見表1。

表1 AMACR在肝細(xì)胞癌及其癌旁組織中的表達(dá)Tab.1 Expression of AMACR in HCC and pericancerous tissue ［n(%)］

進(jìn)一步分析Ki-67在HCC及其癌旁組織中表達(dá)顯示(見表2)，HCC組織中顯示Ki-67標(biāo)記指數(shù)高，提示癌巢中的腫瘤細(xì)胞比癌旁異型增生肝細(xì)胞增殖活性高。

2.2 免疫熒光Ki-67分別與AMACR和RAS雙標(biāo)記染色

HCC及其癌旁異型增生肝細(xì)胞Ki-67和AMACR的表達(dá)以及Ki-67和RAS表達(dá)的激光共聚焦顯微鏡定位分析。紅色信號代表AMACR，分布于細(xì)胞漿，綠色信號代表 Ki-67，定位于細(xì)胞核。HCC組織顯示AMACR強(qiáng)陽性表達(dá)，并見大量Ki-67陽性細(xì)胞，提示癌細(xì)胞增殖活躍(圖1B);癌旁異型增生肝細(xì)胞顯示局灶性AMCR強(qiáng)表達(dá)，有少數(shù)Ki-67表達(dá)細(xì)胞，提示有一定增殖活性(圖1C)。HCC組織RAS和Ki-67雙標(biāo)記，胞漿中等表達(dá)RAS蛋白，Ki-67陽性細(xì)胞較多見。實驗結(jié)果顯示，在肝細(xì)胞癌組織和癌旁異型增生的肝細(xì)胞中AMACR與Ki-67表達(dá)較一致。

表2 RAS和Ki67在肝細(xì)胞癌及其癌旁組織中的表達(dá)Tab.2 Expression of RAS and Ki67 in HCC and pericancerous tissue ［n(%)］

圖1 免疫熒光Ki-67分別與AMACR和RAS雙標(biāo)記染色Fig.1 Double-labelled immunofluorescence staining(B and C:AMACR with Ki-67;D:RAS with Ki-67)

3 討 論

AMACR參與HCC癌旁肝細(xì)胞異型增生至癌變的臨床病理生物學(xué)行為相關(guān)的機(jī)制目前尚不清楚。已知AMACR在線粒體和過氧化酶體內(nèi)參與脂肪酸支鏈及其衍生物的β氧化代謝過程中起重要作用［5-6］。已證明過氧化氫產(chǎn)物可引起基因和染色體異常，而中間代謝產(chǎn)物可致線粒體損傷，還可與過氧化酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR)結(jié)合［7］。PPAR 是細(xì)胞核受體轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，與其配體即過氧化酶體增殖物結(jié)合，可以激活PPAR調(diào)節(jié)路徑，影響細(xì)胞的增生、分化和細(xì)胞內(nèi)氧化劑的平衡，參與腫瘤的形成［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)，HCC癌旁肝硬化組織中RAS的表達(dá)主要呈小灶性強(qiáng)表達(dá)，這一表達(dá)及分布特征與鄭杰等［9］研究二乙基亞硝胺誘發(fā)大鼠肝癌變過程中N-ras、c-myc和Ha-ras基因及其蛋白原位表達(dá)的結(jié)果一致，有關(guān)機(jī)制有待闡明。

本組免疫熒光雙標(biāo)記顯示，AMACR與RAS表達(dá)伴隨細(xì)胞增殖活性變化趨勢是一致的。HCC組織中AMACR呈彌漫強(qiáng)表達(dá)時，RAS也明顯表達(dá)，其Ki-67標(biāo)記的細(xì)胞增殖活性較高。統(tǒng)計分析提示，兩者彌漫性表達(dá)的這種分布特征呈正相關(guān)。在癌旁肝組織，AMACR呈灶性強(qiáng)陽性表達(dá)，RAS也呈灶性弱表達(dá)，增殖活性較低。這可能與肝細(xì)胞癌變需要一個多步驟基因改變的蓄積過程和串話機(jī)制有關(guān)。RAS參與AKT/mTOR和Ras/MAPK信號機(jī)制的序貫機(jī)制［10］，其信號通路活化將促進(jìn)HCC發(fā)生。RAS還可能通過 Ras/Raf/ERK和 Ras/Raf/JNK信號通路影響細(xì)胞周期而促進(jìn)細(xì)胞增生參與腫瘤的發(fā)生［11］。靶向RAS信號通路將可抑制腫瘤形成［11］。本組實驗顯示AMACR在HCC及其癌旁異型增生肝細(xì)胞中表達(dá)變化特征，與RAS的原位定位趨勢一致，提示有可能AMACR參與RAS信號調(diào)控通路機(jī)制，從而促進(jìn)肝細(xì)胞異型增生和HCC的發(fā)生。該假設(shè)有待基因調(diào)控實驗進(jìn)一步闡釋。

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