關建洪，朱樂樂，林 欣，賈鑫明

(同濟大學醫(yī)學院免疫學教研室，上海 200092)

C型凝集素受體(C-type lectin receptor，CLR)是一類模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，可以識別病原體細胞壁上的糖成分，在抗真菌免疫中發(fā)揮重要作用。Dectin-2(dendritic cellassociated C-type lectin-2)和Dectin-3(dendritic cellassociated C-type lectin-3)屬于CLR中的Dectin-2家族，參與機體抗真菌固有免疫應答［1］。dectin-2和dectin-3基因位于人12號染色體和小鼠6號染色體NK基因復合體(natural killer-gene complex，NKC)的端粒區(qū)［2］，其基因結構在人和小鼠中高度保守，氨基酸同源性分別為 73.9%與 67.3%。Dectin-2和Dectin-3在樹突狀細胞和巨噬細胞等固有免疫細胞上廣泛表達，其結構包括胞質區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)，胞外區(qū)具有一個碳水化合物識別域(carbohydrate-recognization domain，CRD)，可結合糖結構。Dectin-2和Dectin-3胞內既不含有ITIM基序也不含有ITAM基序，但在識別白色念珠菌菌絲態(tài)表面分子α-mannans后可通過FcRγ激活Syk，誘導CARD9/Bcl10/MALT1形成復合體，進而激活NF-κB，表達 TNF-α、IL-1β 和 IL-6等促炎細胞因子，啟動機體的抗真菌感染固有免疫應答，并介導適應性免疫應答［3-8］。本研究通過克隆dectin-2和dectin-3胞外區(qū)基因并進行原核表達，以純化的蛋白為抗原免疫小鼠，篩選獲得特異性分泌Dectin-2和Dectin-3單克隆抗體的單克隆雜交瘤細胞，并初步鑒定其生物學活性，為進一步研究Dectin-2和Dectin-3的生物學功能研究提供有效的工具。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒 pET28a(+)、pRV3-Dectin-2、pRV3-Dectin-3及菌株E.coliDH5α與BL21(DE3)由本實驗室保存;RT-PCR反應試劑盒、高保真DNA聚合酶購自美國TaKaRa公司;限制性內切酶BamHⅠ、XholⅠ和T4 DNA連接酶購自美國Thermo公司;質粒提取試劑盒購自美國Axygen公司;PCR產物純化試劑盒、Cy3標志的山羊抗鼠IgG購自美國Life Technologies公司;Ni-NTA His Bind瓊脂糖樹脂購自德國Novagen公司;anti-His抗體購自美國AbMART公司;HRP標志的山羊抗鼠IgG購自北京鼎國昌盛生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 pET28a(+)-Dectin-2 與 pET28a(+)-Dectin-3重組表達質粒的構建與鑒定 以人外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)cDNA為模板，分別擴增dectin-2與dectin-3基因的胞外區(qū)DNA序列。上、下游引物見表1。上、下游引物的5'端分別引入BamHⅠ和XholⅠ酶切位點。擴增條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán);72℃ 7 min;4℃保存。用BamHⅠ和XholⅠ分別雙酶切上述PCR產物和pET28a(+)原核表達載體;T4 DNA連接酶連接后將連接產物轉入E.coliDH5α中培養(yǎng)，挑取單克隆進行酶切鑒定及測序。

表1 引物列表Tab.1 Primer list

1.2.2 Dectin-2和Dectin-3胞外區(qū)蛋白的原核表達與純化 將構建好的重組質粒pET28a(+)-Dectin-2和pET28a(+)-Dectin-3分別轉化至E.coliBL21(DE3)中，經0.02 mol/L IPTG 25℃誘導表達10 h后，收集細菌，用PBS洗滌1次，再重懸于PBS中，超聲波裂解，10 000 r/min，離心半徑98 mm，離心30 min，分別取少量上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍染色，結果顯示大部分蛋白存在于沉淀中。取沉淀，按照Ni-NTA His Bind瓊脂糖樹脂試劑盒提供的方法，柱層析純化蛋白。考馬斯亮藍染色檢測目的蛋白的純度;以anti-His鼠源單克隆抗體為一抗，Western印跡法檢測目的蛋白的表達與抗原性。

1.2.3 Dectin-2和Dectin-3胞外區(qū)蛋白單克隆抗體的制備 將純化好的Dectin-2和Dectin-3胞外區(qū)蛋白分別與等體積弗氏完全佐劑(CFA)混勻并充分乳化后，將該乳劑在Balb/c小鼠(4只)雙肩周圍進行皮下注射和后腿進行肌肉注射，每個區(qū)域大約用1/8的免疫原，接著將1/2的免疫原進行腹腔注射。首次免疫抗原劑量為100 μg;首次免疫后第2周進行第2次加強免疫，免疫抗原劑量為50 μg;首次免疫后第3周第3次免疫，改用不完全弗氏佐劑(IFA)，免疫抗原劑量為50 μg;首次免疫后第4周進行第4次免疫，不使用佐劑，直接用溶于PBS中的50 μg抗原免疫小鼠;第4次免疫后1周，眼眶取血，分離血清，用ELISA和Western印跡法檢測血清抗體生物學活性。用PEG方法將小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞F0進行融合。用Dectin-2和Dectin-3胞外區(qū)蛋白分別對融合的雜交瘤克隆進行篩選，檢測它們的特異性和敏感性。ELISA陽性的克隆再用Western印跡法檢測，篩選出來的克隆再做2次亞克隆。篩選得到陽性單克隆雜交瘤細胞腹腔注射接種至F1小鼠中(4×106/只)，10～14 d后取腹水，純化，得到單克隆抗體。

1.2.4 血清抗體滴度的測定 采用ELISA法，以純化的Dectin-2和Dectin-3胞外區(qū)蛋白(100 ng/孔)作為包被抗原，一抗為鼠抗血清(1∶500～1∶256 000)，同時用免疫前血清做陰性對照，二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG，TMB顯色，在450 nm處測定吸光度值(D450)。

1.2.5 FACS分析檢測Dectin-2與Dectin-3抗體特異性 用慢病毒方法分別將pRV3-Dectin-2和pRV3-Dectin-3轉染至RAW 細胞中，使其分別穩(wěn)定表達人Dectin-2和Dectin-3。以純化的Dectin-2和Dectin-3單克隆抗體為一抗，Cy3標記的羊抗鼠IgG為二抗，分別對穩(wěn)定表達人Dectin-2和Dectin-3的RAW細胞進行間接免疫熒光染色，以正常小鼠IgG為陰性對照，用流式細胞儀進行分析、檢測Dectin--2和Dectin-3單克隆抗體的特異性。

1.2.6 Western印跡法檢測 Dectin-2與 Dectin-3抗體交叉反應性 提取穩(wěn)定表達人Dectin-2和Dectin-3的RAW細胞及野生型小鼠骨髓來源的巨噬細胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)的總蛋白，Western印跡法檢測Dectin-2與Dectin-3抗體的交叉反應性。

1.2.7 Dectin-2與 Dectin-3抗體功能實驗檢測

將穩(wěn)定表達人Dectin-2、Dectin-3的RAW 細胞和野生型小鼠BMDM分別用IgG及Dectin-2、Dectin-3單克隆抗體封閉1 h后，加入菌絲態(tài)白色念珠菌刺激1 h，提取核蛋白，考察NF-κB(p65亞基)的激活情況以此檢測抗體是否具有封閉性功能。

2 結 果

2.1 重組質粒 pET28a(+)-Dectin-2與 pET28a(+)-Dectin-3的構建與鑒定

以人外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)cDNA為模板，分別擴增dectin-2和dectin-3基因的胞外區(qū)DNA序列，產物片段約為500 bp，見圖1A。將產物片段經BamHⅠ與XholⅠ雙酶切后克隆至pET28a(+)質粒中。酶切鑒定，測序結果與Genebank報告的基因序列完全相符，見圖1B，表明將dectin-2與dectin-3基因的胞外區(qū)分別成功克隆到pET28a(+)質粒中。

圖1 人dectin-2和dectin-3基因胞外區(qū)的擴增克隆與重組質粒pET28a(+)-Dectin-2、pET28a(+)-Dectin-3的酶切鑒定Fig.1 Cloning of human dectin-2 and dectin-3 extracellular region and restriction enzyme analysis of the recombinant plasmids pET28a(+)-Dectin-2 and pET28a(+)-Dectin-3

2.2 Dectin-2和Dectin-3胞外區(qū)的原核表達、純化與鑒定

用0.02 mol/L IPTG分別對轉化pET28a(+)-Dectin-2和pET28a(+)-Dectin-3質粒的E.coliBL21(DE3)25℃誘導表達10 h后，收集細菌，用PBS洗滌 1次，再重懸于 PBS，超聲波裂解，10 000 r/min，離心半徑98 mm，離心30 min，棄去上清液，取沉淀，按照Ni-NTA His.Bind瓊脂糖樹脂試劑盒提供的方法，柱層析純化蛋白?？捡R斯亮藍染色檢測目的蛋白的純度，得到高純度的目的蛋白，見圖2A;Western印跡法檢測結果表明目的蛋白表達正確，見圖2B。

圖2 SDS-PAGE電泳分析純化的Dectin-2和Dectin-3胞外區(qū)蛋白Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified Dectin-2 and Dectin-3 extracellular region proteins

2.3 Dectin-2和Dectin-3血清抗體活性的測定

ELISA法測定鼠血清抗體效價，Dectin-2與Dectin-3血清抗體陰性對照D450值依次為0.058 5和0.055 8，血清抗體稀釋度2 倍遞減，當Dectin-2與Dectin-3血清抗體稀釋度分別達到1∶256 000時檢測結果仍為陽性(圖3A)，表明Dectin-2與Dectin-3血清抗體都具有很高的效價。Western印跡法檢測血清抗體結合活性發(fā)現(xiàn)，Dectin-2與Dectin-3血清抗體能分別特異結合Dectin-2與Dectin-3胞外區(qū)的原核表達蛋白(圖 3B)。

圖3 Dectin-2與Dectin-3血清抗體活性的測定Fig.3 Identification of the Dectin-2 and Dectin-3 antibodies activity

2.4 Dectin-2與Dectin-3單克隆抗體特異性與識別鼠Dectin-2與Dectin-3的檢測

融合雜交瘤細胞后，分別獲得8株Dectin-2和12株Dectin-3的陽性雜交瘤細胞;進一步克隆化篩選(ELISA檢測，D450＞1.00)獲得7株Dectin-2和8株Dectin-3的單克隆細胞株，并且其分泌的抗體能夠特異結合Dectin-2和Dectin-3胞外區(qū)的原核表達蛋白(圖4A、4B)。利用單克隆細胞株制備小鼠腹水，純化獲得Dectin-2和Dectin-3的單克隆抗體。隨機挑取純化的Dectin-2和Dectin-3的單克隆抗體各1株。FACS檢測顯示，Dectin-2單克隆抗體D2-7只能識別穩(wěn)定轉染pRV3-Dectin-2的RAW細胞上表達的人 Dectin-2分子，并不識別穩(wěn)定轉染pRV3-Dectin-3的RAW細胞上表達的人Dectin-3分子;而Dectin-3單克隆抗體D3-2也只識別人Dectin-3分子，并不識別人 Dectin-2分子，說明制備的Dectin-2和Dectin-3單克隆抗體具有高度的特異性。經BLAST比對發(fā)現(xiàn)，Dectin-2和Dectin-3基因結構在人和小鼠中高度保守，其胞外區(qū)氨基酸同源性分別高達74.1%和65.4%(圖4C、4D)。以單克隆抗體D2-7或D3-2為一抗，Western印跡法檢測顯示，單克隆抗體D2-7和D3-2能夠分別特異結合RAW中表達的人Dectin-2和Dectin-3蛋白及小鼠BMDM 中的Dectin-2和Dectin-3蛋白(圖4E、4F)，說明制備的Dectin-2和Dectin-3單克隆抗體也具有很強的識別鼠Dectin-2與Dectin-3的能力，而這正是由于dectin-2和dectin-3基因結構在人和小鼠中高度保守性。

圖4 Dectin-2和Dectin-3單克隆抗體特異性與交叉反應性的測定Fig.4 Identification of the specificity and cross-reactivity of Dectin-2 and Dectin-3 mAbs

2.5 抗體功能實驗

研究［5-8］表明，Dectin-2與 Dectin-3都能識別白色念珠菌菌絲態(tài)，并激活NF-κB。用白色念珠菌菌絲態(tài)(MOI=0.1)分別刺激穩(wěn)定表達人Dectin-2和Dectin-3的RAW 細胞時，都可激活 NF-κB(p65亞基)，而利用Dectin-2與Dectin-3單克隆抗體分別預處理RAW時發(fā)現(xiàn):Dectin-2單克隆抗體D2-7和D2-10能夠阻斷Dectin-2受體介導白念珠菌菌絲態(tài)刺激引起的NF-κB激活，說明D2-7和D2-10具有封閉性作用，但D2-12并無封閉性作用而具有激活性作用(圖5A);Dectin-3單克隆抗體D3-1和D3-2能夠阻斷Dectin-3受體介導白念珠菌菌絲態(tài)刺激引起的NF-κB激活，說明D3-1與D3-2都具有封閉性作用，但D3-2的封閉性作用更強(圖5B)。

用白色念珠菌菌絲態(tài)刺激野生型小鼠BMDM細胞時，隨著MOI的增高，NF-κB的激活程度也不斷增強，見圖5C。20 μg/ml的單克隆抗體D2-7與D3-2均能完全阻斷MOI=0.1時刺激所引起的NF-κB激活;20 μg/ml的單克隆抗體D2-7也可完全阻斷MOI=0.5時刺激所引起的 NF-κB激活(圖5C);而20 μg/ml的單克隆抗體D3-2并不能阻斷MOI=0.5時刺激所引起的NF-κB激活，需D3-2的濃度增大到60 μg/ml才能完全阻斷(圖5D)。這說明單克隆抗體D3-2的封閉性作用具有劑量依賴性，也說明單克隆抗體D2-7與D3-2的親和力不同，即D2-7對Dectin-2的親和力遠高于D3-2對Dectin-3的親和力。

利用正常小鼠IgG作為對照，進一步驗證單克隆抗體D2-7和D3-2的封閉性作用，結果表明，單克隆抗體D2-7和D3-2的封閉性作用具有高度特異性(圖5E)，而并不是非特異性結合，這一結果與圖4C、4D的結果相一致。

圖5 Dectin-2與Dectin-3單克隆抗體的功能檢測Fig.5 Identification of the function of monoclonal antibodies against Dectin-2 and Dectin-3

3 討 論

Dectin-2和Dectin-3是介導機體抗真菌感染固有免疫應答的主要受體，在巨噬細胞和樹突狀細胞等固有免疫細胞上高度表達。研究［5-10］表明，Dectin-2和Dectin-3可以形成異源二聚體，共同識別白色念珠菌菌絲態(tài)，并通過募集FcRγ激活Syk-CARD9-NF-κB通路，啟動固有免疫應答效應，發(fā)揮抗白色念珠菌感染作用。Dectin-2分子可能與多種自身免疫性疾病相關，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風濕性關節(jié)炎和Ⅰ型糖尿病等［3，11］;同時，分布于表皮組織的Dectin-2在調節(jié)紫外線誘導的免疫抑制中也發(fā)揮著重要作用［12］。因此，Dectin-2分子作為一個多功能的受體，在機體的免疫調節(jié)和穩(wěn)態(tài)維持兩方面發(fā)揮著極其重要的作用［3］。而Dectin-3在機體免疫調節(jié)與穩(wěn)態(tài)維持中的作用尚有待進一步研究。

抗體是研究分子結構和功能過程中一種非常重要的工具［13］，為此本研究制備了Dectin-2和Dectin-3的單克隆抗體。本實驗克隆了人 Dectin-2和Dectin-3的胞外區(qū)片段，構建了pET28a(+)-Dectin-2與pET28a(+)-Dectin-3原核表達質粒。這兩種原核表達質粒在E.coliBL21(DE3)中均可高效表達重組蛋白。利用純化的目的蛋白免疫Balb/c小鼠制備特異性單克隆抗體，經 ELISA、FACS和Western印跡法檢測，制備的單克隆抗體具有較高的效價和高度特異性。同時，制備的 Dectin-2和Dectin-3單克隆抗體具有交叉反應性，能夠分別特異結合人和鼠的Dectin-2與Dectin-3蛋白。此外，本實驗還成功篩選出了Dectin-2和Dectin-3的封閉性單克隆抗體。Dectin-2和Dectin-3蛋白及其單克隆抗體的成功制備，特別是封閉性單克隆抗體的成功制備，為進一步研究Dectin-2與Dectin-3的生物學功能及進一步尋找針對Dectin-2與Dectin-3信號通路的相關疾病的治療藥物奠定了實驗基礎。對于Dectin-2等C型凝集素受體的進一步深入研究將有利于我們對機體的免疫調節(jié)和穩(wěn)態(tài)維持有更為深入的認識，從而對真菌感染和自身免疫性疾病的治療、疫苗的研制以及新藥的研發(fā)等起著指導作用。

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