谷曉媛，張為強(qiáng)，林萬隆

(上海市閘北區(qū)市北醫(yī)院腫瘤?？?，上海 200435)

胃癌是威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，患病率和死亡率位居我國(guó)城市的第2位，農(nóng)村的第1位［1］。相關(guān)研究表明泰素帝等紫杉類化療藥物有激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的作用，由于NF-κB具有促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、抗凋亡等作用，因此其激活在一定程度上拮抗了泰素帝對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是一種巰基化合物，具有抗氧化效應(yīng)，為NF-κB抑制物。因此推測(cè)PDTC可能增加泰素帝的化療療效，本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察PDTC合并泰素帝對(duì)體外培養(yǎng)的SGC-7901人胃癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)，并研究藥物作用后NF-κB P65、IκB蛋白及凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)家族包括XIAP及c-IAP2的表達(dá)變化，旨在人胃癌細(xì)胞系SGC-7901中研究PDTC對(duì)于泰素帝化療療效的影響，以及研究其可能的作用機(jī)理，為臨床胃癌提供更為有效的治療方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SGC-7901人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)液中(RIPM 1640+10%FBS+1%P/S+1%Glutamax)，用 Hepes調(diào)節(jié)pH值為7.2，加雙抗(青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml)，置于 5%CO2培養(yǎng)箱 37 ℃ 培養(yǎng)，以0.02%EDTA、0.25% 胰酶消化，每 2～3 d傳代1次。

1.2 分組

對(duì)照組:加等量Hanks液對(duì)照，37℃培養(yǎng);PDTC組:加PDTC(Sigma公司)至終濃度100 μmol/L，作用24 h;化療組:泰素帝(法國(guó)羅納普朗克·樂安公司)藥物濃度分別為 0.1 μg/ml(D1)、1.0 μg/ml(D2)、5.0 μg/ml(D3)高、中、低三個(gè)濃度組，作用 24 h;聯(lián)合用藥組:先加PDTC至終濃度100 μmol/L，作用2 h后再分別加入不同濃度的泰素帝，即0.1 μg/ml(D1P)、1.01 μg/ml(D2P)、5.01 μg/ml(D3P)，作用24 h。

1.3 MTT 檢測(cè)

取生長(zhǎng)良好、處于對(duì)數(shù)增生期的細(xì)胞，消化后接種于96孔板，每孔30 000/100 μl，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后隨機(jī)分組處理，每組設(shè)3個(gè)平行孔。于處理結(jié)束后CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h，取出細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄去存留的孵育液，于測(cè)試前每孔加入DMSO 100 μl，充分溶解結(jié)晶物，在酶標(biāo)儀上于490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔光密度(D490)值。計(jì)算抑制率:

1.4 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

將SGC-7901人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分組，分別采用100 μmol/L PDTC、1.0 μg/ml泰素帝及二者聯(lián)合作用24 h后測(cè)定細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD Pharmingen公司)染色，BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率，按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)c-IAP2及XIAP基因表達(dá)

將SGC-7901人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分組，分別采用 100 μmol/L PDTC、1.0 μg/ml泰素帝及二者聯(lián)合作用24 h后，TRIzol(Invitrogen公司)提取總RNA，根據(jù)Fermentas公司的M-MLV操作說明書采用 Oligo(dT)為引物將 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA凍存于 －20℃。引物序列見表1。Eppendorf Realplex熒光定量PCR儀，SYBR Green法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件:95℃ 2 min，95℃變性15 s，59℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。用ΔΔCt法進(jìn)行各基因表達(dá)的相對(duì)定量。

表1 XIAP和c-IAP2基因qPCR檢測(cè)引物信息Tab.1 Primers of XIAP and c-IAP2 genes

1.6 Western 印跡法檢測(cè) NF-κB P65、I-κB 蛋白的表達(dá)

將SGC-7901人胃癌細(xì)胞培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分組，分別采用 100 μmol/L PDTC、1.0 μg/ml泰素帝及二者聯(lián)合作用24 h后，采用核質(zhì)分離試劑盒(碧云天公司，P0028)按照試劑盒操作說明書提取細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)蛋白，采用Lowry法進(jìn)行蛋白定量，取20 μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳、半干轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)，采用免疫發(fā)光法進(jìn)行蛋白條帶顯影、拍照、灰度。內(nèi)參GAPDH蛋白抗體:GAPDH pAb(Bioworld，AP0063)，1∶5 000 稀釋，蛋白大小:36 000;NF-κB P65 蛋 白 抗 體:NF-κB pAb(cell signal，#3034)，1∶1 000 稀釋，蛋白大小:65 000;IκB α 蛋白抗體:IκB pAb(cell signal，#9242)，1∶1 000 稀釋，蛋白大小:35 000。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞凋亡結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)，其他結(jié)果采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法測(cè)定泰素帝合并PDTC對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用

SGC-7901細(xì)胞經(jīng)不同條件處理后，結(jié)果顯示各處理組細(xì)胞生長(zhǎng)均發(fā)生了不同程度的抑制現(xiàn)象(P＜0.05)，隨著泰素帝濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸下降，但各泰素帝組細(xì)胞D490值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);聯(lián)合用藥進(jìn)一步提高泰素帝對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)，聯(lián)合用藥組較相應(yīng)濃度泰素帝組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表2。

表2 泰素帝合并PDTC對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖能力的影響Tab.2 Inhibition of SGC-7901 cell proliferation by taxotere combined with PDTC

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PDTC及泰帝素作用后SGC-7901人胃癌細(xì)胞的凋亡率

100 μmol/L PDTC、1.0 μg/ml泰素帝及二者聯(lián)合作用24 h，均能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡(圖1)?？瞻讓?duì)照組、聯(lián)合用藥組、泰素帝組、PDTC組的平均凋亡率分別為:9.32% ±1.63%，29.37% ±2.62%，22.40% ±1.41%，20.81% ±0.15%。各藥物處理組的凋亡率高于對(duì)照組(P＜0.01)，PDTC處理和泰素帝處理后的凋亡率相差不大都在20%左右(P＞0.05)，但是兩個(gè)藥物聯(lián)合作用時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯升高，達(dá)到29.37%，與泰素帝及PDTC單藥組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，這個(gè)結(jié)果與前期MTT的結(jié)果趨勢(shì)基本一致。

圖1 PDTC和泰素帝處理后SGC-7901細(xì)胞凋亡檢測(cè)Fig.1 SGC-7901 cell apoptosis after treated with PDTC and taxotere

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)藥物處理后SGC-7901細(xì)胞內(nèi)c-IAP2及XIAP mRNA的表達(dá)

SYBR Green法檢測(cè)XIAPmRNA及c-IAP2 mRNA的擴(kuò)增曲線見圖2，溶解曲線見圖3，反應(yīng)特異性高?；虮磉_(dá)的半定量分析結(jié)果見表3、表4。PDTC組XIAPmRNA表達(dá)較對(duì)照組下降(P=0.05)，泰素帝組XIAPmRNA表達(dá)較對(duì)照組升高(P=0.032)，而合并組XIAPmRNA表達(dá)較對(duì)照組、泰素帝組明顯下降(P＜0.01)，說明聯(lián)合使用PDTC可抑制泰素帝應(yīng)用后導(dǎo)致的XIAPmRNA表達(dá)升高。PDTC組c-IAP2 mRNA表達(dá)較對(duì)照組下降(P=0.022)，泰素帝組c-IAP2 mRNA表達(dá)較對(duì)照組升高(P=0.046)，合并組c-IAP2 mRNA表達(dá)較對(duì)照組、泰素帝組明顯下降(P＜0.01)，說明聯(lián)合使用PDTC同樣可抑制泰素帝應(yīng)用后導(dǎo)致的c-IAP2 mRNA表達(dá)升高。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)目的基因擴(kuò)增曲線Fig.2 Amplification curves of target genes by real-time quantitative PCR detection

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)目的基因溶解曲線Fig.3 Melting curves of target genes by real-time quantitative PCR detection

2.4 Western印跡法檢測(cè)藥物處理后SGC-7901細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65及IκB蛋白的表達(dá)

采用免疫發(fā)光法進(jìn)行蛋白條帶顯影，采用灰度分析法進(jìn)行蛋白條帶半定量分析。結(jié)果顯示泰素帝處理后胞漿NF-κB P65含量增加，但經(jīng)檢驗(yàn)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，泰素帝作用后胞核 NF-κB P65蛋白含量顯著增加(P＜0.01);PDTC處理后胞漿及胞核NF-κB P65含量降低(P＜0.05)，聯(lián)合作用后胞漿及胞核NF-κB P65蛋白的含量較泰素帝組及對(duì)照組明顯下降(P＜0.01)。各藥物作用組IκB含量較對(duì)照組均降低(P＜0.05)，但各藥物組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。說明NF-κB抑制劑PDTC可顯著抑制NF-κB P65蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。

表3 目的基因XIAP表達(dá)的半定量分析Tab.3 Semi-quantitative analysis of target gene XIAP expression (x±s)

表4 目的基因c-IAP2表達(dá)的半定量分析Tab.4 Semi-quantitative analysis of target gene c-IAP2 expression (x±s)

圖4 Western印跡法檢測(cè)藥物處理后SGC-7901細(xì)胞內(nèi)NF-κB P65及IκB蛋白的表達(dá)Fig.4 Expressions of NF-κB P65 and IκB protein in drug-treated SGC-7901 cells by Western Blot

表5 SGC-7901細(xì)胞 NF-κB P65及IκB蛋白Western印跡法檢測(cè)灰度分析結(jié)果Tab.5 Grayscale analysis results of NF-κB P65 and I-κB protein in drug-treated SGC-7901 cells by Western blotting

3 討 論

胃癌對(duì)化療產(chǎn)生耐受被認(rèn)為是治療失敗的主要原因，其中腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗，被認(rèn)為是腫瘤對(duì)化療產(chǎn)生耐受的一個(gè)極為重要的原因［2-4］，并且腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗可能在治療的過程中獲得并得到加強(qiáng)。NF-κB是普遍存在于細(xì)胞質(zhì)中以p50/p65異二聚體為形式的一種核轉(zhuǎn)錄因子，與NF-κB 的抑制性蛋白(inhibitor kappa B，IκB)結(jié)合而呈非活性狀態(tài)，可以被多種外來信號(hào)如細(xì)胞因子(TNFα、IL-1、LIF)，應(yīng)激，物理損傷(紫外線、γ射線)，化療藥物(順鉑、阿糖胞苷)等激活［5-6］。激活的NF-κB與IκB解離后轉(zhuǎn)位入核與靶基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子上的κB位點(diǎn)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)許多靶基因 (如 cyclinD1，VEGF，bcl-2，IAPs)的 表達(dá)［7-10］，參與癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、血管生成及凋亡。因此有效地抑制NF-κB的活性可以抑制癌細(xì)胞的進(jìn)展。

PDTC作為NF-κB抑制物，目前認(rèn)為它主要的抑制機(jī)制為:通過降低脂質(zhì)過氧化物酶活性，抑制IκB的降解，減少NF-κB的核轉(zhuǎn)位;通過與巰基結(jié)合，影響 NF-κB的 DNA 結(jié)合活性;抑制 IKKα、IKKβ、IKKγ 的表達(dá)［11］。

研究表明，NF-κB信號(hào)通路在眾多腫瘤細(xì)胞系內(nèi)處于持續(xù)激活的狀態(tài)［5-6］。本研究實(shí)驗(yàn)表明，NF-κB信號(hào)通路在SGC-7901人胃癌細(xì)胞系內(nèi)亦處于持續(xù)激活的狀態(tài)。泰素帝及PDTC單藥均可抑制SGC-7901人胃癌細(xì)胞系的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，100 μmol/L PDTC作用于SGC-7901細(xì)胞24 h后細(xì)胞增殖抑制率為21.76%，與趙維波等［12］的研究相近。泰素帝在抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也激活了NF-κB的活性、促進(jìn)其入核。而合并使用PDTC后，細(xì)胞的增殖抑制率及凋亡率均較泰素帝單藥組有顯著提高，說明PDTC可增強(qiáng)泰素帝的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，抑制泰素帝應(yīng)用后導(dǎo)致的NF-κB P65蛋白進(jìn)入細(xì)胞核。降低其下游靶基因XIAP及c-IAP2 mRNA表達(dá)，研究結(jié)果與趙維波等［12］的免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果一致。本研究MTT法結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖抑制率較相應(yīng)濃度的泰素帝相比，均有明顯的增加，呈現(xiàn)一加一大于二的協(xié)同作用。但是細(xì)胞凋亡結(jié)果卻未顯示相同的趨勢(shì)，表現(xiàn)為一加一小于二的現(xiàn)象，可能因?yàn)樘┧氐圩鳛橐环N化療藥物，其導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的方式是多種多樣的，包括直接引起細(xì)胞壞死，并非局限于誘導(dǎo)凋亡這種方式。此外，引起細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路除了NF-κB通路外，還有其他很多復(fù)雜交叉的信號(hào)通路。未來需進(jìn)一步進(jìn)行其他信號(hào)通路的相關(guān)研究以進(jìn)一步揭示其協(xié)同作用機(jī)制。

以上結(jié)果表明，抗氧化劑PDTC與泰素帝聯(lián)合運(yùn)用，具有彌補(bǔ)泰素帝的活化 NF-κB通路這一不足，加強(qiáng)泰素帝對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)合目前臨床上胃癌化療中泰素帝的廣泛開展，二硫代氨基甲酸鹽類NF-κB抑制物可以作為一種協(xié)同藥物或增敏劑，應(yīng)用于胃癌的臨床實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)踐，改善胃癌的治療效果，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。未來需進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物學(xué)、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證其療效及安全性。

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