沈溪明，郭友逢，何欣欣，孫 倩，陳耿標(biāo)，葉 明，曾韻潔

(中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣州510120)

血管生成擬態(tài)(VM)是腫瘤細(xì)胞形成的可以運(yùn)送血液和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的管道樣結(jié)構(gòu)，是腫瘤組織內(nèi)除血管外的另一種血液供應(yīng)方式。研究發(fā)現(xiàn)，VM與腫瘤的進(jìn)展及患者預(yù)后存在密切關(guān)系［1］。人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)是判斷乳腺癌患者預(yù)后的重要因子［2，3］。但HER-2蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增與乳腺癌患者VM的相關(guān)性尚不清楚。2012年10月～2013年6月，我們觀察了乳腺癌組織中HER-2蛋白表達(dá)和基因擴(kuò)增狀態(tài)及VM表現(xiàn)，探討三者之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科存檔的乳腺癌石蠟標(biāo)本200例，均為女性，年齡42～85(50.24 ±9.57)歲，腫瘤直徑(3.54 ±0.21)cm。病理類(lèi)型:乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌176例，乳腺小葉癌18例，乳腺髓樣癌4例，其他2例。所有患者術(shù)前均未接受化療或基因治療。

1.2 觀察項(xiàng)目

1.2.1 VM病理改變 采用CD34和PAS雙重染色法。常規(guī)石蠟切片，脫水后EDTA抗原修復(fù)，根據(jù)免疫組化Envision二步法常規(guī)行 CD34染色，DAB顯色，鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞著色后終止顯色，行PAS復(fù)染，蒸餾水沖洗，蘇木精染核，封片。VM通道內(nèi)無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，通道外基底膜PAS染色為陽(yáng)性。

1.2.2 HER-2蛋白表達(dá) 采用免疫組化法。常規(guī)石蠟切片，二甲苯脫蠟后梯度酒精脫水，EDTA抗原修復(fù)后PBS沖洗，滴加HER-2抗體孵育1 h，PBS沖洗，滴加廣譜二抗，常溫下孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。HER-2蛋白陽(yáng)性為細(xì)胞膜呈棕褐色。細(xì)胞膜完整或不完整著色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞10%為陽(yáng)性。細(xì)胞膜未著色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性。

1.2.3 HER-2基因擴(kuò)增 采用熒光原位雜交法。常規(guī)石蠟標(biāo)本切片，脫蠟、水化，30%酸性亞硫酸、SSC緩沖液沖洗，蛋白酶K漂洗，0.1 mmol/L HCl漂洗，酒精脫水，丙酮浸泡3 min，將10 μL變性的DNA探針混合物與樣本雜交，蓋玻片覆蓋后置于42℃濕盒中孵育過(guò)夜，用50%甲酰胺和SSC緩沖液各沖洗3次，沖洗后滴加10 μL DAPI復(fù)染細(xì)胞核，400倍光鏡下觀察。正常細(xì)胞核存在1個(gè)綠色和1個(gè)紅色信號(hào)。若單個(gè)細(xì)胞核中紅色≥2個(gè)，但紅色信號(hào)/綠色信號(hào)值(50個(gè)細(xì)胞核)＜1.8為無(wú)HER-2基因擴(kuò)增;1.8～2.2為可疑，需增加選擇計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)至100個(gè);＞2.2為基因擴(kuò)增陽(yáng)性。

1.2.4 相關(guān)性分析及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 分析HER-2蛋白表達(dá)、基因擴(kuò)增與VM的相關(guān)性，分析三者與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，兩組計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用四格表χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VM病理觀察 由腫瘤細(xì)胞圍成的不規(guī)則管道樣結(jié)構(gòu)，無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，CD34染色陰性，PAS陽(yáng)性，可見(jiàn)淡紅色基底膜，管腔內(nèi)存在紅細(xì)胞，周?chē)鸁o(wú)炎性或壞死組織。乳腺癌組織中VM總陽(yáng)性率為49.0%(98/200)。

2.2 HER-2蛋白表達(dá)及基因擴(kuò)增情況 乳腺癌組織中HER-2蛋白陽(yáng)性率和基因擴(kuò)增率分別為67.5%(135/200)、19.0%(38/200)。

2.3 HER-2蛋白表達(dá)、HER-2基因擴(kuò)增、VM陽(yáng)性率與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 HER-2蛋白表達(dá)及HER-2基因擴(kuò)增與腫瘤直徑和組織學(xué)分級(jí)相關(guān)(P均＜0.05)，VM陽(yáng)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級(jí)相關(guān)(P均＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 HER-2蛋白表達(dá)、HER-2基因擴(kuò)增、VM與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.4 HER-2表達(dá)、基因擴(kuò)增與VM的關(guān)系 乳腺癌VM陽(yáng)性組中，HER-2蛋白及基因擴(kuò)增陽(yáng)性率明顯高于VM陰性組(P均＜0.05)，見(jiàn)表2。

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)，內(nèi)皮細(xì)胞形成的新生血管被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞獲得血液支持的惟一途徑。但近年研究發(fā)現(xiàn)，單純的抗腫瘤性血管形成治療并沒(méi)有顯著改善患者的預(yù)后，仍有半數(shù)以上患者存在復(fù)發(fā)而死亡［4］。VM是近年來(lái)提出的全新的腫瘤性血管形成模式，是獨(dú)立于內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的另一種腫瘤性微循環(huán)模式，具有運(yùn)輸血液和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能，但沒(méi)有內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，由腫瘤細(xì)胞圍繞形成不規(guī)則管道，可與宿主的微血管相通，從而滿(mǎn)足腫瘤的惡性生長(zhǎng)、侵襲的需要，為腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供機(jī)會(huì)［5］。研究表明，在人體多種腫瘤如肝癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌和黑色素瘤中均存在VM的表達(dá)［6～8］。張旭等［9］研究發(fā)現(xiàn)，VM陽(yáng)性的乳腺癌患者遠(yuǎn)期生存率明顯低于VM陰性患者，復(fù)發(fā)率明顯高于VM陰性患者。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是VM陽(yáng)性患者腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入血液系統(tǒng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后差。此外，可以形成VM的腫瘤組織惡性程度比較高，分化低，更具有未分化或分化不成熟的表現(xiàn)［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，在200例乳腺癌組織中VM陽(yáng)性率為69.0%，VM陽(yáng)性與乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分化程度密切相關(guān)，而與乳腺癌患者年齡、腫瘤大小等無(wú)明顯相關(guān)。

表2 HER-2表達(dá)、基因擴(kuò)增與VM的關(guān)系(例)

HER-2是參與腫瘤生長(zhǎng)、分化和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的重要因子。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中HER呈高表達(dá)，并參與腫瘤的增殖與凋亡［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中HER-2蛋白陽(yáng)性率和基因擴(kuò)增率分別為67.5%和19.0%，兩者均與腫瘤大小和組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，而與患者年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān);另外，本研究發(fā)現(xiàn)，HER-2與VM存在密切相關(guān)性，VM陽(yáng)性者中HER-2陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于VM陰性者，提示HER-2可以通過(guò)激活下游相關(guān)基因促進(jìn)與VM相關(guān)的分子表達(dá)。國(guó)外有研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在HER-2基因存在的情況下，腫瘤細(xì)胞可圍繞形成血管樣，而敲除HER-2基因后，腫瘤細(xì)胞相關(guān)的VM則不能形成或形成能力較弱［12，13］。研究認(rèn)為其可能機(jī)制是HER-2通過(guò)活化酪氨酸激酶，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，激活相關(guān)基因，并促進(jìn)細(xì)胞糖代謝、氧運(yùn)輸和腫瘤性血管形成過(guò)程中的相關(guān)靶基因，從而通過(guò)啟動(dòng)一系列分子事件，促使腫瘤不斷形成腫瘤性血管以保證腫瘤生長(zhǎng)所需的血液供應(yīng)，促進(jìn)VM形成［14］，因此，HER-2可能是 VM 形成和腫瘤惡性生長(zhǎng)的促進(jìn)因素。

目前關(guān)于HER-2促進(jìn)VM的具體機(jī)制尚不清楚，本研究后續(xù)將從細(xì)胞學(xué)水平進(jìn)一步研究，為乳腺癌提高更新的診療思路。

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