烏倫吉如嘎，阿 青，哈斯畢力格

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014109；2.內(nèi)蒙古呼倫貝爾市鄂溫克旗巴彥托海鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，內(nèi)蒙古 海拉爾 021100；3.金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010030）

布魯氏菌病（簡稱布病）是由布魯氏菌引起的，以流產(chǎn)、早產(chǎn)等繁殖障礙和關(guān)節(jié)炎為主要特征的人畜共患傳染病，是B類動物疫病。布病分布廣，傳染快，危害大，給畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康帶來極大的危害[1]。20世紀80年代布病疫情趨于平穩(wěn)，甚至有些國家已宣布消滅了此病，但近年來有些國家和地區(qū)又開始暴發(fā)流行，我國人畜布病疫情明顯回升，局部地區(qū)甚至出現(xiàn)暴發(fā)[2]。內(nèi)蒙古曾是我國布病嚴重流行地區(qū)之一，目前布病疫情呈現(xiàn)明顯回升之勢[3]。

近幾年包頭市部分地區(qū)個體養(yǎng)殖戶和養(yǎng)牛小區(qū)流產(chǎn)、早產(chǎn)等疑似布魯氏菌病的奶牛比較多見。因此，為查明這些奶牛流產(chǎn)等是否由于布魯氏菌病引起的，對某養(yǎng)牛小區(qū)進行了布魯氏菌病診斷。

1 試驗材料

1.1 病料

流產(chǎn)胎兒的肝、脾、肺、胎衣，流產(chǎn)母牛陰道分泌物、乳汁和血清。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、肝浸湯、肝浸湯瓊脂培養(yǎng)基、增菌液、布魯氏菌陽性血清、布魯氏菌陰性血清、布魯氏菌虎紅平板凝集抗原、試管凝集抗原、各種生化試劑及培養(yǎng)基等。

2 試驗方法

2.1 抹片染色鏡檢

將病料切面在載玻片上抹片，自然干燥后用革蘭氏染色法、萋-尼氏染色法和科茲洛夫斯基染色法染色，在顯微鏡下觀察，布魯氏菌為紅色革蘭氏球桿菌。

2.2 分離培養(yǎng)

將流產(chǎn)胎兒的肝、脾、肺、胎衣、母牛陰道分泌物及牛乳分別接種于增菌液培養(yǎng)基和肝浸湯培養(yǎng)基內(nèi)，分別置大氣條件和5%～10%CO2環(huán)境條件下，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)3～7 d，劃線轉(zhuǎn)接于胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基和肝浸湯瓊脂培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況，如有菌落生長，對可疑菌落進行涂片染色鏡檢，再做純化培養(yǎng)，并進行生化鑒定試驗。如無菌落生長，則繼續(xù)培養(yǎng)15～30 d。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 生化鑒定

將培養(yǎng)純化后的細菌分別做微量糖發(fā)酵培養(yǎng)（葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、木糖）、甲基紅（MR）試驗、V-P試驗、吲哚試驗、尿素酶試驗、明膠液化試驗、檸檬酸鹽利用試驗、硝酸鹽還原試驗、觸酶試驗、石蕊牛乳試驗。

2.3.2 血清凝集試驗

將分離出的細菌分別與布病標準陽性、陰性血清作凝集試驗。在干凈的載玻片上各滴1滴布病標準陽、陰性血清，然后用接種環(huán)取培養(yǎng)48 h的待檢培養(yǎng)物少許，分別與陽、陰性血清混勻，1～2 min，用肉眼觀察凝集反應(yīng)，出現(xiàn)凝集顆粒反應(yīng)呈陽性；不出現(xiàn)凝集顆粒反應(yīng)呈陰性。同時設(shè)生理鹽水對照。

2.4 血清學(xué)診斷

流產(chǎn)奶牛血清做虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗，按照GB/T18646-2002的方法操作。

3 試驗結(jié)果

3.1 鏡檢結(jié)果

流產(chǎn)胎兒組織臟器抹片，經(jīng)革蘭氏染色、萋-尼氏染色及科茲洛夫斯基染色鏡檢，2號和5號病料中發(fā)現(xiàn)單個、革蘭氏陰性紅色球桿菌，其余的病料未見可疑細菌。

3.2 分離培養(yǎng)結(jié)果

5份流產(chǎn)胎兒病料接種的增菌液培養(yǎng)基和肝浸湯培養(yǎng)基經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)無色透明、細小、圓形、隆起的菌落，菌落表面光滑濕潤，邊緣整齊。其中2和5號病料接于胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基和肝浸湯瓊脂培養(yǎng)基上初次培養(yǎng)只在5%～10%CO2環(huán)境條件下生長，大氣環(huán)境條件不生長，但經(jīng)傳代后可在大氣環(huán)境條件下生長；其余1、3和4號檢樣只在大氣環(huán)境條件下生長，而在5%～10%CO2環(huán)境條件下不生長。

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，2和5號菌株革蘭氏染色呈陰性球狀小桿菌，單個存在；萋-尼氏染色呈鮮紅色球桿狀；科茲洛夫斯基染色為紅色球桿狀，符合布魯氏菌的形態(tài)及染色特性（與病料染色鏡檢的結(jié)果一致）。

3.3 病原菌鑒定結(jié)果

3.3.1 生化鑒定結(jié)果

將分離出的5株菌進行純培養(yǎng)后，分別接種于各種生化培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)觀察及試驗鑒定，只有2號和5號菌株符合布魯氏菌的生化特性，其生化鑒定結(jié)果見表1。

表1 生化鑒定結(jié)果

3.3.2 血清凝集試驗結(jié)果

將分離出的5株細菌分別與布病標準陽性、陰性血清作凝集試驗，結(jié)果2號菌株和5號菌株與陽性血清出現(xiàn)凝集顆粒呈陽性反應(yīng)，其他3株菌沒有出現(xiàn)凝集顆粒呈陰性反應(yīng)；與陰性血清作凝集試驗均沒有出現(xiàn)凝集顆粒呈陰性反應(yīng)，生理鹽水對照組無凝集現(xiàn)象。

通過以上細菌形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化試驗、玻片凝集試驗，從2號和5號檢樣中分離到的病原菌為牛種布魯氏菌。

3.4 血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷結(jié)果見表2。

由表2可知，5份流產(chǎn)奶牛血清經(jīng)虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗檢測結(jié)果全部為陽性，且牛群未接種布魯氏菌病疫苗，由此可以判定流產(chǎn)的5頭奶牛已感染布魯氏菌病。

表2 血清學(xué)診斷結(jié)果

4 討論

對5份流產(chǎn)奶牛血清進行虎紅平板凝集試驗（RBPT）和試管試驗（SAT）檢測，結(jié)果全部呈陽性，RBPT和SAT陽性率均為100%。血清學(xué)診斷方法的特異性不強，有時可出現(xiàn)假陽性或假陰性現(xiàn)象，如需要確診應(yīng)結(jié)合其他診斷方法。

本次試驗對5份流產(chǎn)奶牛病料進行了病原培養(yǎng)，分離出5株可疑菌落，其中2號和5號菌株經(jīng)病原染色鏡檢、生化試驗和血清凝集試驗鑒定為牛種布魯氏菌，病原培養(yǎng)陽性率40%。布魯氏菌病是一種持續(xù)感染疾病，如早期得不到良好的治療可轉(zhuǎn)為慢性布病，病情時好時壞，引起波浪熱[4]。病牛在發(fā)熱期間才能排出病原體，且布魯氏菌對培養(yǎng)條件要求較苛刻，所以病原分離培養(yǎng)的成功率不高。微生物學(xué)診斷方法可以確定其生物型，是最可靠、最確切的診斷方法，可對流行病學(xué)研究和疫情控制、消滅提供科學(xué)依據(jù)。

5 小結(jié)

綜合各種診斷結(jié)果，確定2號和5號奶牛感染了布魯氏菌病，該養(yǎng)牛小區(qū)奶牛流產(chǎn)的主要原因是由于布魯氏菌病引起。布魯氏菌病病畜在發(fā)熱期間可成為傳染源，排出病原菌，污染環(huán)境、用具、飼料和水源等，引起周圍健康牛的感染[5-6]。應(yīng)采取合理的防疫措施，防止疫情的擴散和蔓延。養(yǎng)牛小區(qū)應(yīng)對全群奶牛進行布病檢疫，感染牛應(yīng)及時淘汰，同群牛隔離觀察并定期檢疫，污染的環(huán)境和用具等嚴格的消毒，流產(chǎn)的胎兒、胎盤和尸體要無害化處理；由于布病是人畜共患病，危害非常嚴重，所以對養(yǎng)牛小區(qū)的飼養(yǎng)人員、獸醫(yī)等易感人群應(yīng)采取相應(yīng)的防護措施，必要時候免疫接種。對周圍的動物食品交易市場、屠宰場、倉庫等加強衛(wèi)生監(jiān)督，以防病畜及其產(chǎn)品流入而擴散疫情；加大宣傳力度，加深對布病的認識；周圍地區(qū)的動物進行布病的檢疫，禁止由疫區(qū)購入動物及其產(chǎn)品和飼料等，避免帶入布病；故意隱瞞疫情不報和轉(zhuǎn)移病畜等違法現(xiàn)象應(yīng)嚴格按照有關(guān)規(guī)定進行處理。

[1] 楊蓮茹,烏倫吉如嘎,王建明,等.奶牛布魯氏菌病病原PCR檢測方法的建立[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,28（2）:1-5.

[2] 楊海榮,關(guān)平原,范偉興.AMOS PCR在布魯氏菌種型鑒定中應(yīng)用的研究[J].中國動物檢疫,2007,24（10）:25-28.

[3] 吳從雅.內(nèi)蒙古自治區(qū)布魯氏菌病疫情趨勢及原因分析[J].內(nèi)蒙古地方病防治研究,1994,19（3）:101-102.

[4] 尚德秋.布魯氏菌病再度肆虐及其原因[J].中國地方病防治雜志,2001,16（1）:29-34.

[5] 烏倫吉如嘎,楊連茹,楊富貴.內(nèi)蒙古某養(yǎng)牛小區(qū)流產(chǎn)奶牛的布魯桿菌病檢測[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2011（8）:84.

[6]李向陽.內(nèi)蒙古通遼地區(qū)奶牛布魯氏菌病流行病學(xué)調(diào)查和感染機理初步分析[D].長春:吉林大學(xué),2013.