魏百合 葉 芳 李國霞 王宏偉 周文峰 甄 禎 喬振華

山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院血液科，太原 030013

凋亡抑制基因在急性白血病及骨髓增生異常綜合征中的研究

魏百合 葉 芳▲李國霞 王宏偉 周文峰 甄 禎 喬振華

山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院血液科，太原 030013

目的 探討急性白血病及骨髓增生異常綜合征患者骨髓凋亡抑制基因MCL-1、livin、aven的表達及臨床意義。 方法 選取2012年9月～2013年12月本院收治的113例初發(fā)急性白血病患者，32例骨髓增生異常綜合征患者及20例對照組患者（缺鐵性貧血12例、血小板減少性紫癜8例）的新鮮骨髓液標本，采用RT-PCR方法檢測MCL-1、livin、aven基因mRNA的表達水平及表達率。 結果AL組和MDS組MCL-1、livin、aven mRNA表達水平及陽性表達率分別高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。MCL-1與livin基因mRNA的表達呈正相關（r= 0.586，P＜0.05），MCL-1與aven基因的表達呈正相關（r=0.603，P＜0.05），liven基因與aven基因表達無相關性（r=0，P＞0.05）。 結論 3種凋亡抑制基因MCL-1、livin、aven基因mRNA在急性白血病及骨髓增生異常綜合征中表達均增高。

MCL-1；Livin；Aven；急性白血病；骨髓增生異常綜合征

細胞凋亡是多基因參與并嚴格控制的過程，可清除衰老、受損及有惡變傾向的細胞，對機體維持正常生理活動極為重要。凋亡過度將會提早終止正常細胞的活動，影響正常的生理功能；凋亡受抑將導致細胞存活時間延長，使易轉化突變的細胞大量生長積累，最終導致腫瘤的發(fā)生，同時凋亡受抑也是導致癌細胞對化療藥物耐藥的一個重要因素。近年來，關于細胞凋亡在急性白血?。╝cute leukemia，AL）及骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）發(fā)病機制中的研究越來越多。凋亡抑制基因在AL發(fā)病機制中的研究較多，但在MDS發(fā)病機制中的作用研究較少。MDS具有向AL轉化的高風險，所以明確凋亡抑制基因在MDS中的表達特點，有助于明確凋亡抑制基因在MDS中的發(fā)病機制，進而為MDS的靶向治療提供理論依據(jù)。本課題主要對凋亡抑制基因MCL-1、livin、aven在初發(fā)AL和MDS患者中的表達進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2012年9月～2013年12月本院收治的113例初發(fā)AL、32例MDS及20例（缺鐵性貧血12例、血小板減少性紫癜8例）對照組患者的新鮮骨髓液標本，其中急性淋巴細胞白血病 （acute lymphoblastic leukemia，ALL）33例，男18例，女15例；急性髓細胞性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）80例，男46例，女34例；MDS患者32例，男14例，女18例。標本收集及提取總RNA，用EDTA抗凝管收集研究對象新鮮骨髓液1～2 ml。

1.2 標本采集方法

選取研究對象左或右側髂后上脊為穿刺點，常規(guī)皮膚穿刺點碘伏消毒3次，戴無菌手套，鋪無菌洞巾，抽取2%利多卡因注射液2 ml，自皮膚至骨膜逐層麻醉，麻醉后用穿刺針自穿刺點皮面進針，抵骨膜后左右旋轉，進入骨髓腔，用20 ml無菌干燥注射器抽取2 ml新鮮骨髓液，用EDTA抗凝管收集。

1.3 實驗方法及步驟

1.3.1 提取總RNA 采用Takara公司Trizol試劑提取研究對象新鮮骨髓液總RNA，并測定提取的RNA濃度，操作步驟如下：①1000 μl ddH2O+300 μl（新鮮骨髓液）裂解細胞，混勻，靜置10 min；②12 000 r/min，4℃，離心1 min，棄上清（直接倒掉，少量用槍吸）；③加800 μl Trizol（用槍吹起沉淀），再加160 μl氯仿（三氯甲烷）充分混勻；④12 000 r/min，4℃，離心10 min，取出時避免搖晃；⑤EP管（新）加異丙醇300 μl，少量（30 μl）的吸取上清于異丙醇中（≥200 μl），注意不要吸中間的白色沉淀物（蛋白），緩慢搖50次混勻，避免劇烈搖晃導致RNA斷裂；⑥12 000 r/min，4℃，離心5 min，棄異丙醇（倒掉即可）；⑦加70%乙醇300 μl（用槍把沉淀吹起來）；⑧12 000 r/min，4℃，離心2 min，棄乙醇（充分棄凈，倒掉后，用離心機甩一下，再用強吸，別碰壁，晾干）；⑨加RNA溶解液20～30 μl（依量而定）DEPC水；⑩置-20℃保存。

1.3.2 cDNA的合成 引物設計均由上海生工生物工程公司合成。MCL-1：正義鏈為5′-CAAAAACGAAGACGATGTGAAA-3′，反義鏈為5′-AAAGGCACCAAAAGAAATGAGA-3′，擴增產物長度為109 bp；livin：正義鏈為5′-GAGCCAGTGTTCCCTCCAT-3′，反義鏈為5′-CTCCTCCTCTTCCTCCTCTGTC-3′，擴增產物長度為224 bp；aven：正義鏈為5′-ATGGAACCTGAGCAACCAAGTA-3′，反義鏈為5′-CGTTAGAAGGCAACCAAGATTT-3′，擴增產物長度為128 bp；GAPDH：正義鏈為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，反義鏈為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，擴增產物長度為224 bp?？偡磻w系為10 μl，包括總RNA 2 μl、5×Prime ScriptRBuffer 2 μl、RNase Free dH2O 6 μl，混勻后，用離心機甩至底部；反應條件為37℃、15 min（反轉錄反應），85℃、5 s（反轉錄酶的失活反應），降至4℃，反應終止。

1.3.3 PCR 按照PCR反應試劑盒（Takara公司）說明書操作步驟進行。PCR反應體系為20 μl，包括逆轉錄產物2 μl，上、下游引物各0.8 μl，SYBRRPremix Ex TaqTmⅡ（2×）10 μl，ROX Reference Dye（50×）0.4 μl，dH2O 6 μl。擴增條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火31 s，40個循環(huán)。

1.3.4 2-ΔΔCt法 采用 2-ΔΔCt法分析基因相對表達量，ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt對照，ΔCt=Ct（樣本/對照）-Ct內參。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關性采用Pearson相關分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組MCL-1、livin、aven表達水平及表達率的比較

AL組和MDS組MCL-1、livin、aven mRNA的表達水平及陽性表達率分別高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 3組MCL-1、livin、aven mRNA表達水平及陽性表達率的比較

2.2 MCL-1、livin、aven的相關性分析

MCL-1與livin的基因表達呈正相關 （r=0.586，P＜0.05），在AL及MDS中表達均升高；MCL-1與aven的基因表達呈正相關 （r=0.603，P＜0.05），在AL 及MDS中表達均升高；liven與aven的基因表達無相關性（r=0，P＞0.05）。

2.3 MCL-1、livin、aven的擴增曲線和溶解曲線

內參基因GAPDH及凋亡抑制基因MCL-1、livin、aven的擴增曲線見圖1～圖4；MCL-1、livin、aven的融解曲線見圖5。

圖1GAPDH擴增曲線

圖2MCL-1基因擴增曲線

圖3 livin基因擴增曲線

圖4 aven基因擴增曲線

圖5 MCL-1、livin、aven基因融解曲線

3 討論

目前AL及MDS的具體發(fā)病機制尚不十分明確，但是MDS有向AL轉化的高風險。凋亡抑制基因參與腫瘤細胞的生長增殖，與腫瘤細胞的存在密切相關，研究凋亡抑制基因在惡性腫瘤中的作用機制，可以為惡性腫瘤的靶向治療提供科學依據(jù)。

髓樣細胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，MCL-1）基因是Bcl-2凋亡控制基因家族中的調控成員之一，MCL-1與Bcl-2間具有部分同源序列，Bcl-2家族中抗凋亡成員和促凋亡成員間可競爭性形成同源或異源二聚體（如Bcl-2/Bax、MCL-1/Bax等）而決定細胞是否凋亡[1]，以調控細胞生存或凋亡平衡。MCL-1的過表達可以促進腫瘤形成，MCL-1的表達下調可促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖并導致其細胞周期阻滯；MCL-1在正常細胞及多種實體腫瘤及血液系統(tǒng)疾病中均有表達，MCL-1位于線粒體外膜，通過形成異源二聚體和（或）中和Bcl-2家族促凋亡蛋白（Bim或Bak），抑制細胞色素C釋放，從而抑制細胞凋亡[2]。一直認為livin抑制細胞的程序化死亡（programmed cell death，PCD），即凋亡是通過直接抑制凋亡蛋白酶而實現(xiàn)。Vucic等[3]研究發(fā)現(xiàn)，livin可與caspase-3、caspase-9及caspase-9前體發(fā)生免疫共沉淀現(xiàn)象，由此推斷l(xiāng)ivin可以通過抑制caspase-3 及caspase-9的活性而抑制細胞凋亡。aven已被確定為細胞凋亡的抑制劑，其作用機制為結合適配器蛋白APAF-1，防止凋亡體形成和線粒體凋亡[4]。

MDS早期有過多的凋亡發(fā)生，隨著疾病進展，疾病后期，在抗凋亡基因作用下，MDS會向AL轉化[5]。Bar等[6]采用RT-PCR方法對MCL-1在5例正常對照與11例MDS不同亞型中的表達進行分析，發(fā)現(xiàn)MCL-1表達在MDS患者骨髓液與正常骨髓液對照相比明顯降低，且在MDS各亞型中表達逐漸減少。Economopoulou等[7]在對50例MDS不同亞型研究中發(fā)現(xiàn)，抗凋亡基因Bcl-xL和MCL-1表達增加，與低危組相比，MCL-1在MDS高危組中表達明顯增加，而 caspase-8、caspase-3、caspase-6、caspase-5、caspase-2、caspase-7和顆粒酶 B在MDS中的表達下降，表明MCL-1在MDS的發(fā)生、發(fā)展中抑制了有惡性潛能的細胞凋亡，且MCL-1與凋亡信號蛋白caspase-8、caspase-3、caspase-6、caspase-5、caspase-2、caspase-7在MDS中的表達可能呈負相關。本研究中MCL-1在AL、MDS中表達均增高，與Economopoulou 等[7]研究結果一致，但與Bar等[6]研究結果不一致，可能與其研究標本量少有關，也可能MCL-1在MDS中的作用機制有其他途徑而改變了mRNA表達量，有待進一步研究。蘆慧霞等[8]在研究Bcl-2基因家族成員調控2-甲氧基雌二醇（2-ME）誘導MDS細胞凋亡的機制中發(fā)現(xiàn)，2-ME增強細胞內caspase-3活性，呈濃度和時間依賴性（P＜0.05）；隨著2-ME濃度增加，細胞內MCL-1 mRNA表達下降（P＜0.05），且MCL-1 mRNA表達量與相應時間點caspase-3活性呈負相關（r=-0.992，P＜0.01），表明2-ME可能通過下調MCL-1表達和增強caspase-3活性的途徑來調控MDS細胞凋亡，加速細胞凋亡。

Wang等[9]采用RT-PCR方法研究抗凋亡基因livin在急性非淋巴細胞性白血病（ANLL）細胞中的表達水平，結果顯示46例ANLL成年患者中l(wèi)ivin基因的mRNA水平與正常對照組比較，ANLL患者livin基因的mRNA水平顯著高于正常對照組，同時降低患者均完全緩解，在復發(fā)的ANLL患者中，livin的表達水平再次升高。livin基因的高表達可能成為ANLL預后不良的標志物。Lü等[10]采用RT-PCR和Western blot方法研究siRNA對K562細胞livin表達和功能的影響，結果表明livin基因的siRNA可以抑制livin的抗凋亡作用，通過下調livin基因的表達，從而阻止疾病進展，這可能提供了新的抗白血病的研究方法。Choi 等[11]采用RT-PCR方法研究222例兒童ALL患者livin的表達，結果顯示有良好預后因素的患者，livin基因的表達率和表達水平均較高，經(jīng)過7 d誘導化療骨髓反應良好的患者表達率也較高（P＜0.05）；livin基因表達與復發(fā)缺失相關，類似的有l(wèi)ivin基因表達的患者比無livin基因表達患者的無復發(fā)存活率高（P＜0.05）；無復發(fā)存活率的多因素分析表明，livin基因在兒童ALL的表達是一個獨立的預后良好因素。李建廠等[12]采用RT-PCR方法檢測31例ALL及22例AML患兒白血病細胞livin mRNA的表達水平，結果表明在AML和ALL患兒中l(wèi)ivin mRNA的表達均增高，且livin mRNA陽性患兒的緩解率明顯低于livin mRNA陰性患兒。李文琦[13]采用半定量逆轉錄PCR方法檢測95例成人ALL患者骨髓中l(wèi)ivin mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)livin在ALL中表達增高，且與ALL的預后相關。耿素霞等[14]在應用RT-PCR方法檢測69例AML患者凋亡抑制基因aven mRNA的表達情況時，發(fā)現(xiàn)初發(fā)AML患者aven基因mRNA的表達水平顯著升高，且aven mRNA在復發(fā)組較無復發(fā)組中表達明顯升高，表明aven mRNA的表達與AML的發(fā)病及進展可能有關。Eiβmann等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，aven在AL中表達增高，可以視為血液系統(tǒng)腫瘤的癌蛋白。Choi等[15]在研究91例兒童ALL中aven mRNA的表達在ALL組中顯著高于正常對照組，提示aven基因是ALL的不良預后因素。

本研究結果顯示，MCL-1、livin、aven三種凋亡抑制基因在AL及MDS中表達均增高，對于復發(fā)組表達高于緩解組，有待進一步驗證；三種凋亡抑制基因在AL及MDS中表達比對照組高，但MDS標本量有限，在MDS不同亞型中的表達有待進一步研究；三種基因的表達存在相關性；凋亡抑制基因的表達可能與MDS的分型相關；三種基因可作為判斷AL預后的新指標，為惡性血液病的靶向治療及評估預后提供依據(jù)；MDS的診斷與靶向治療能否從這三種凋亡抑制基因中找到新的突破，需進一步研究。

[1]Jacobson MD.Apoptosis:Bcl-2-related proteins get connected[J].Curr Biol，1997，7（5）：R277-R281.

[2]Cuconati A，Mukherjee C，Perez D，et al.DNA damage response and MCL-1 destruction initate apoptosis in adenovirus-infected cells[J].Genes Dev，2003，17（23）：2922-2932.

[3]Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML-IAP,a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas[J].Curr Biol，2000，10（21）：1359-1366.

[4]Eiβmann M，Melzer IM，F(xiàn)ernández SB，et al.Overexpression of the anti-apoptotic protein AVEN contributes to increased malignancy in hematopoietic neoplasms[J].Oncogene，2013，32（20）：2586-2591.

[5]Parker JE，Mufti GJ，Rasool F，et al.The role of apoptosis, proliferation,and the Bcl-2-related proteins in the myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia secondary to MDS[J].Blood，2000，96（12）：3932-3938.

[6]Bar M，Stirewalt D，Pogosova-Agadjanyan E，et al.Gene expression patterns in myelodyplasia underline the role of apoptosis and differentiation in disease initiation and progression[J].Transl Oncogenomics，2008，3：137-149.

[7]Economopoulou C，Pappa V，Papageorgiou S，et al.Cell cycle and apoptosis regulatory gene expression in the bone marrow of patients with de novo myelodysplastic syndromes(MDS)[J].Ann Hematol，2010，89（4）：349-358.

[8]蘆慧霞，夏國華，陳寶安，等.Mcl-1和Bax基因在2-甲氧基雌二醇誘導骨髓增生異常綜合征細胞凋亡中的調控作用[J].中國實驗血液學雜志，2009，17（5）：1246-1248.

[9]Wang XJ，Sun H，Wang GY，et al.Expression of anti-apoptosis livin gene in acute non-lymphocytic leukemia cells and its clinical significance[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2008，16（1）：35-37.

[10]Lü J，Chen ZC，Li QB，et al.siRNA-induced down-regulation of Livin expression increases spontaneous apoptosis in K562 cell line[J].Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2012，20（2）：258-261.

[11]Choi J，Hwang YK，Sung KW，et al.Expression of Livin,an antiapoptotic protein,is an independent favorable prognostic factor in childhood acute lymphoblastic leukemia [J].Blood，2007，109（2）：471-477.

[12]李建廠，賈秀紅，唐慎華，等.Livin基因在兒童急性白血病中的表達及其意義[J].腫瘤防治研究，2012，39（1）：41-43.

[13]李文琦.Livin和Survivin在成人急性淋巴細胞白血病中的表達及臨床意義[D].長沙：中南大學，2010.

[14]耿素霞，杜欣，翁建宇，等.凋亡抑制基因aven在急性髓系白血病的表達及其臨床意義[J].中國實驗血液學雜志，2009，17（6）：1424-1428.

[15]Choi J，Hwang YK，Sung KW，et al.Aven overexpression:association with poor prognosis in childhood acute lymphoblastic leukemia[J].Leuk Res，2006，30（8）：1019-1025.

Thereserch ofapoptosissuppressorgenein acuteleukemia and myelodysplastic syndrome

WEI Bai-he YE Fang▲LI Guo-xia WANG Hong-weiZHOU Wen-feng ZHEN Zhen QIAO Zhen-hua
Department of Hematology,the Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030013,China

ObjectiveTo study the expression of the apoptosis suppressor MCL-1,livin and aven in acute leukemia and myelodysplastic syndrome and its clinical significance.Methods113 patients with newly diagnosed acute leukemia patients were selected from September 2012 to December 2013 in our hospital,32 cases of myelodysplastic syndrome patients and 20 cases of control group patients(12 patients with iron deficiency anemia,8 cases with thrombocytopenia purpura),whose fresh bone marrow samples were collected.RT-PCR method was used for detection of MCL-1,livin,aven gene expression and mRNA expression.ResultsThe mRNA expression and positive expression rate of MCL-1,livin, aven in AL group and MDS group was higher than that in control group respectively,with statistical difference(P＜0.05). The expression of MCL-1 was positively correlated to the expression of livin(r=0.586,P＜0.05),the expression of MCL-1 was positively correlated to the expression of aven(r=0.603,P＜0.05),no correlation between the expression of livin and the expression of aven(r=0,P>0.05).ConclusionThe expression of apoptosis suppressor MCL-1,livin and aven were upregulated in aute leukemia and myelodysplastic syndrome.

MCL-1;Livin;Aven;Acute leukemia;Myelodysplastic syndrome

R557

A

1674-4721（2014）03（c）-0015-05

2014-01-26本文編輯：李亞聰）

山西省國際科技合作項目 （2012081044-1）；山西省留學基金（晉留管辦發(fā)[2009]9號106）；山西省人事廳歸國留學人員擇優(yōu)資助項目（晉財社[2011]172號）

▲通訊作者