嚴(yán) 鵬 任麗娟 成 振 郭大瑋▲ 白麗娟 賈琳娜

1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，太原 030001；2.山西大醫(yī)院，太原 030032

MSRE-qPCR法檢測(cè)少弱精子癥患者父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平

嚴(yán) 鵬1任麗娟2成 振1郭大瑋1▲白麗娟1賈琳娜1

1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，太原 030001；2.山西大醫(yī)院，太原 030032

目的 建立精子中父源印記基因H19上游區(qū)域MSRE-qPCR檢測(cè)方法，并分析男性少弱精子癥患者精子父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平。 方法 收集20例正常精液樣本，同時(shí)篩選30例少弱精子癥患者精液樣本，應(yīng)用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶法并結(jié)合定量PCR對(duì)所有樣本父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平進(jìn)行分析。 結(jié)果 正常精液樣本父源印記基因H19上游區(qū)域平均甲基化率為（99.8±2.72）%，高于少弱精子癥患者精液樣本的（82.4±15.30）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 結(jié)論MSRE-qPCR法可用于父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平的檢測(cè)，少弱精子癥者精液樣本父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平顯著低于正常人。

印記基因H19；MSRE-qPCR；少弱精子癥；DNA甲基化

目前，全球約15%的育齡夫婦存在不孕不育，其中與男性相關(guān)的因素約占50%，同時(shí)該比例還在逐年增加[1]。導(dǎo)致男性不育的主要因素為精子異常，包括少精子癥、弱精子癥和畸形精子癥等，已有學(xué)者研究證明父源印記基因H19甲基化狀態(tài)可影響男性精子的生成，且甲基化狀態(tài)降低會(huì)導(dǎo)致男性精子的生成障礙[2]，因此可認(rèn)為父源印記基因H19甲基化狀態(tài)的異?？蓪?dǎo)致男性不育。近年來(lái)，有關(guān)精子基因甲基化狀態(tài)的研究逐漸增多，研究方法多是從半定量水平或間接定量水平進(jìn)行分析，直接從定量水平進(jìn)行分析的較少。本研究將甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶法與定量PCR相結(jié)合，建立精子中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平定量分析方法，同時(shí)篩選30例少弱精子癥患者精液樣本，對(duì)其父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析，探討父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平異常與男性不育的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 精液樣本采集

根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第五版）[3]的標(biāo)準(zhǔn)，收集20例正常精液樣本，同時(shí)篩選30例少弱精子癥患者精液樣本，精液樣本均來(lái)源于2013年11～12月在山西醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院就診的患者。

1.2 精子DNA提取

采用經(jīng)典酚-氯仿法提取精子全基因組DNA，并用紫外分光光度法檢測(cè)所提取DNA的純度及濃度。

1.3 MSRE處理

采用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶HhaⅠ（New England Biolabs）對(duì)所提取精子DNA進(jìn)行酶切消化，同時(shí)對(duì)于同一精液樣本以去離子水代替HhaⅠ設(shè)立未消化對(duì)照，酶切體系：精子基因組DNA為1～20 ng，HhaⅠ為30 U，加入適量Buffer，去離子水補(bǔ)至20 μl，37℃消化16 h，65℃消化20 min停止酶切。

1.4 PCR引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增條件

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選擇人類H19基因上游區(qū)域一段包含4個(gè)HhaⅠ酶切位點(diǎn)的區(qū)域作為第一輪常規(guī)PCR擴(kuò)增區(qū)域，該區(qū)域所包含的4個(gè)HhaⅠ酶切位點(diǎn)在精子DNA中均為高甲基化狀態(tài)，在該區(qū)域兩翼設(shè)計(jì)引物，上游引物5′-GGGTCATTATAGACGCAATCG-3′，下游引物5′-AGAACCTGTTGGGCGGTTAGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1700 bp左右[4]。擴(kuò)增體系：ExTaq Hot Start Version（Takara）為1.25 U，dNTP混合物（Takara）的終濃度為10 mmol/L each，模板為已消化好（對(duì)照組為未消化）的精子DNA 4 μl，引物的終濃度為10 μmol/L each，加入適量緩沖液，去離子水補(bǔ)至50 μl。常規(guī)PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸2 min，共20個(gè)循環(huán)，72℃再延伸5 min。同時(shí)以上一步常規(guī)PCR引物為模板使用Premier Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)第二輪qPCR引物，上游引物5′-CTGGGAACACTGGGA AAG-3′，下游引物5′-AGAAACTGGGCTGATTGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為147 bp，擴(kuò)增體系：2×SYBRRPremix Ex TaqⅡ（Takara）為10 μl，引物的終濃度為10 μmol/L each，取上一步常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍后取1 μl作為模板，去離子水補(bǔ)至20 μl。qPCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，55℃退火20 s，72℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán)，結(jié)束后繪制溶解曲線。

1.5 甲基化水平分析

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線相對(duì)定量法對(duì)精液樣本甲基化水平進(jìn)行分析，以百分?jǐn)?shù)表示甲基化水平，甲基化水平=（消化組定量結(jié)果/未消化組即對(duì)照組定量結(jié)果）× 100%。標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建采用父源印記基因H19標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒（來(lái)源于山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院），標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒經(jīng)梯度稀釋后與精液樣本同時(shí)擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSRE-qPCR方法評(píng)估

2.1.1 HhaⅠ酶切效率評(píng)估 以H19標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒檢測(cè)酶切效率，將50、200、400 ng的H19標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒以HhaⅠ消化16 h后進(jìn)行MSRE-qPCR分析，同時(shí)設(shè)計(jì)未消化對(duì)照，酶切效率=[（未消化定量結(jié)果-消化定量結(jié)果）/未消化定量結(jié)果]×100%，結(jié)果HhaⅠ對(duì)50、200、400 ng的H19標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的酶切效率分別為99.9%、99.9%、99.8%。

2.1.2 PCR引物擴(kuò)增評(píng)估 本研究所設(shè)計(jì)qPCR引物，其線性范圍寬，擴(kuò)增靈敏度高，擴(kuò)增效率為103.9%，相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.999，引物特異性好，在Tm=87.3℃時(shí)出現(xiàn)單一產(chǎn)物峰；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，兩對(duì)引物均擴(kuò)增特異性好，條帶清晰（圖1）。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果

2.2 樣品中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化狀態(tài)的分析

20例正常精液樣本父源印記基因H19上游區(qū)域均為高甲基化狀態(tài)，平均甲基化率為（99.8±2.72）%；30例少弱精子癥患者精液樣本父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化狀態(tài)顯著降低，平均甲基化率為（82.4± 15.30）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在30例少弱精子癥患者精液樣本中，有5例樣本甲基化率為97% ～100%，8例樣本甲基化率為90%～97%，11例樣本甲基化率為 70%～90%，3例樣本甲基化率為 50%～70%，2例樣本甲基化率為30%～50%，1例樣本甲基化率為＜20%（圖2）。

圖2 少弱精子癥患者父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平分布

3 討論

甲基化作為表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一，是蛋白質(zhì)和核酸的一種重要修飾，與生長(zhǎng)發(fā)育、衰老、癌癥及許多疾病密切相關(guān)[5-6]，近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，在精子發(fā)生過程中，DNA甲基化起著重要作用[7]。DNA甲基化的修飾依賴DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 （DNA methyltransferase，DNMT），有研究發(fā)現(xiàn)DNMT3L敲除的雄性小鼠無(wú)生育能力，母鼠的卵子也不能建立正確的印記基因，后代在胚胎期即死亡[8]，Hata等[9-10]的研究指出，DNMT3A、DNMT3L缺陷的小鼠可表現(xiàn)為少精子癥。Li 等[11]在研究中觀察到與正常人相比，少弱精子癥患者的精子質(zhì)量越差，精子DNA甲基化水平越低。Kobayashi等[12]研究了97例不育男性的精液，發(fā)現(xiàn)其中有14.4%的樣本存在父系甲基化印記H19、GTL2的異常。Marques等[2]也指出精子中H19基因甲基化異常程度越嚴(yán)重，精子的異常率越高。精子中H19基因甲基化的異常，可導(dǎo)致精子發(fā)生異常，進(jìn)而導(dǎo)致男性不育。

輔助生育技術(shù) （assisted reproductive technology，ART）可以避開自然受精過程中多種天然屏障而解決男性不育問題。有研究證明精子DNA甲基化的異常并不影響試管嬰兒的受孕率，但精子DNA甲基化的異常可影響胚胎的發(fā)育，進(jìn)而可能導(dǎo)致后代出現(xiàn)各種遺傳疾病[13]。Hansen等[14]的研究表明，通過人工授精懷孕的嬰兒，出生一年內(nèi)被診斷出有嚴(yán)重生理缺陷的概率是自然懷孕所產(chǎn)嬰兒的3倍，因此在進(jìn)行ART前應(yīng)對(duì)精子的甲基化狀態(tài)進(jìn)行仔細(xì)分析，以降低ART的風(fēng)險(xiǎn)。

精子DNA甲基化狀態(tài)研究的主流方法是依賴重亞硫酸鹽修飾并結(jié)合其他相關(guān)技術(shù)進(jìn)行甲基化狀態(tài)的分析，主要包括重亞硫酸測(cè)序、甲基化特異性PCR、甲基化特異性單核苷引物延伸、重亞硫酸鹽限制酶組合分析等[15-17]。重亞硫酸鹽可以將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，這些方法可以很好的分析相關(guān)基因中CpG島的甲基化狀態(tài)，但是其多操作復(fù)雜，工作量大，且在定量方面存在一定局限性。本研究使用MSRE-qPCR法分析精子中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平，其方法操作簡(jiǎn)便，線性范圍寬，靈敏度高，重復(fù)性好，可以快速、定量地分析精子中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平，基本可以達(dá)到科研及臨床檢測(cè)的要求。本研究結(jié)果顯示，少弱精子癥患者精子DNA中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平與正常精子有顯著差異，提示精子DNA H19上游區(qū)域甲基化水平與少弱精子癥有一定相關(guān)性，且少弱精子癥者精子中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平顯著低于正常人。

綜上所述，本研究所建立的方法可以快速、定量地分析精子中父源印記基因H19上游區(qū)域甲基化水平，下一步研究除繼續(xù)篩選不育男性精子中甲基化異常的代表性基因外，還應(yīng)對(duì)不育男性精子DNA中甲基化水平達(dá)到多少即可進(jìn)行ART而不會(huì)產(chǎn)生其他問題等展開深入研究。

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The methylation level detection of the upstream of H19 paternal imprinted gene in olig-asthenospermia patient by MSRE-qPCR

YAN Peng1REN Li-juan2CHENG Zhen1GUO Da-wei1▲BAI Li-juan1JIA Lin-na1
1.Forensic Medicine of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.Shanxi Dayi Hospital,Taiyuan 030032,China

ObjectiveTo establish the methylation level of upstream of H19 paternal imprinted gene in semen of oligasthenospermia patient and analyse the methylation level detection of the upstream of H19 paternal imprinted gene in olig-asthenospermia patient.MethodsThe methylation level in the upstream of the H19 paternal imprinted gene of abnormal(30 olig-asthenospermia samples)and normal(20 normal semen samples)was detected respectively by conducting the methylation sensitive restriction endonucleases-quantitative polymerase chain reaction(MSRE-qPCR,asemiquantitative DNA methylation analytical method).ResultsThe average methylation rate in the upstream of the H19 paternal imprinted gene in normal semen samples was(99.8±2.72)%,higher than that in olig-asthenospermia samples(82.4±15.30)%, with statistical difference(P＜0.01).ConclusionThe method of MSRE-qPCR can be used in the methylation level detection of upstream of the H19 paternal imprinted gene of semen,and the methylation level of upstream of the H19 paternal imprinted gene in olig-asthenospermia patient is much lower than that in normal person.

H19 paternal imprinted gene;MSRE-qPCR;Olig-asthenospermia;DNA methylation

R698

A

1674-4721（2014）03（c）-0012-04

2014-02-11本文編輯：李亞聰）

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（2011 1417110003）

▲通訊作者