貫云娜 吳 昊 楊紹蘭 王成榮

GUAN Yun－na WU Hao YANG Shao－Lan WANG Cheng－rong

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109）

（College of Food Science and Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China）

大蒜為百合科蔥屬植物蒜的鱗莖，含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有藥、食、保健等多種功效，大蒜多糖是其主要活性成分之一［1］。近年來國內(nèi)外研究［2，3］表明，大蒜多糖具有抗菌消炎、抗血凝、降血脂、防止動脈粥樣硬化、保護(hù)肝臟、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力和抗衰老等作用。大蒜中多糖含量較高且較穩(wěn)定，中國具有豐富的大蒜資源，因此采用合適的提取方法提取大蒜多糖具有非常重要的意義。

目前，大蒜多糖的提取方法多為傳統(tǒng)熱水浸提法［4，5］，此法雖然操作簡單，但存在提取時(shí)間長、提取溫度高等缺點(diǎn)［6］。近年來，用于植物活性物質(zhì)提取的綠色新技術(shù)包括超臨界流體萃取［7］、微波輔助提取［8］和超聲波輔助提?。?－11］等。與前兩種提取方法相比，超聲波能夠產(chǎn)生和傳遞強(qiáng)大的能量，加速物質(zhì)中分子的運(yùn)動［12］，可以在較低的溫度下作用，有利于植物細(xì)胞中有效成分的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散；與傳統(tǒng)熱水浸提法相比，有提取時(shí)間短、提取效率高、能耗低和環(huán)保等優(yōu)勢［13］，近年來已被廣泛用于多糖提取。另一方面，細(xì)胞壁降解酶類具有水解原果膠、纖維素和糖蛋白的作用［14］，復(fù)合酶提取由于其具有反應(yīng)條件溫和、提取時(shí)間短、成本較低等優(yōu)勢也被逐漸應(yīng)用到多糖的提取［15，16］。

陳瑞平［15］等曾研究了復(fù)合酶提取大蒜多糖的工藝條件，并確定的最佳酶配比為纖維素酶∶木瓜蛋白酶∶果膠酶＝1∶60∶5。但目前未見針對超聲波與復(fù)合酶同時(shí)作用于大蒜多糖提取的研究報(bào)道。本試驗(yàn)在前期預(yù)試驗(yàn)（確定復(fù)合酶配比：果膠酶22.5 U／g、木瓜蛋白酶160 U／g、纖維素酶96 U／g）的基礎(chǔ)上，擬以大蒜多糖得率為指標(biāo)，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲輔助復(fù)合酶法提取大蒜多糖的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

大蒜：購于青島城陽大潤發(fā)超市；

果膠酶：3萬U／g，天津利華酶制劑技術(shù)有限公司；

木瓜蛋白酶：20萬U／g，天津利華酶制劑技術(shù)有限公司；

纖維素酶：4萬U／g，天津利華酶制劑技術(shù)有限公司；

葡萄糖、無水亞硫酸鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉：濃硫酸、丙酮、無水乙醇、95%無水乙醇：均為國產(chǎn)分析純；

3，5－二硝基水楊酸：化學(xué)純，天津市巴斯夫化工有限公司；

透析袋：截留分子量8 000～14 000，北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平：AR2410型，奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；

組織搗碎勻漿機(jī)：JJ－2（2003－61）型，常州國華電器有限公司；

恒溫超聲提取儀：SY－1000E型，北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司；

紫外－可見分光光度計(jì)：745型，上海光譜儀器有限公司；

離心機(jī)：TDL－5000B型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52AA系列，上海亞榮生化儀器有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB－Ⅲ型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK－S28型，上海市精宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG－9036A型，上海市精宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

真空冷凍干燥機(jī)：ALPHA1－2LDplus型，德國 Christ公司。

1.3 超聲復(fù)合酶法提取大蒜多糖的工藝流程

大蒜瓣→去皮、去蒂、打漿→轉(zhuǎn)入超聲波萃取釜（添加復(fù)合酶攪拌均勻，按液料比補(bǔ)足水）→超聲波復(fù)合酶法提取大蒜多糖→滅酶（提取液在90℃水浴中處理30 s）［17］→過濾→4 000 r／min離心15 min→50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮（至原來體積的1／3）→4倍體積無水乙醇沉淀→依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%乙醇、丙酮和無水乙醇洗滌沉淀［18］→加水復(fù)溶、透析袋透析48 h→真空冷凍干燥→大蒜粗多糖

1.4 熱水浸提法提取大蒜多糖工藝及參數(shù)

新鮮大蒜→脫脂→破碎→熱水浸提（溫度83.57℃、料水比1∶6.97（m∶V）、時(shí)間205.48 min［19］）→過濾→濾液離心→上清液濃縮

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）超聲功率對大蒜多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱取5份100 g新鮮去皮大蒜，加入適量水打漿，按液料比為6∶1（V∶m）補(bǔ)足水，按最佳復(fù)合酶配比加入復(fù)合酶，設(shè)定得超聲溫度為50℃，提取時(shí)間為20 min，采用5個(gè)超聲功率（300，400，500，600，700 W）提取大蒜多糖，經(jīng)滅酶、過濾、離心后測定大蒜多糖含量，計(jì)算多糖得率。

（2）超聲溫度對大蒜多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱取5份100 g新鮮去皮大蒜，加入適量水打漿，按液料比為6∶1（V∶m）補(bǔ)足水，按最佳復(fù)合酶配比加入復(fù)合酶，設(shè)定超聲波功率為400 W，提取時(shí)間為20 min，采用5個(gè)超聲溫度（40，45，50，55，60℃）提取大蒜多糖，經(jīng)滅酶、過濾、離心后測定大蒜多糖含量，計(jì)算多糖得率。

（3）液料比對大蒜多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱取5份100 g新鮮去皮大蒜，加入適量水打漿，按最佳復(fù)合酶配比加入復(fù)合酶，設(shè)定超聲功率為400 W，超聲溫度為50℃，提取時(shí)間為20 min，采用5個(gè)液料比（4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，12∶1（V∶m））補(bǔ)足水提取大蒜多糖，經(jīng)滅酶、過濾、離心后測定大蒜多糖含量，計(jì)算多糖得率。

（4）提取時(shí)間對大蒜多糖得率的影響：準(zhǔn)確稱取5份100 g新鮮去皮大蒜，加入適量水打漿，按液料比為8∶1（V∶m）補(bǔ)足水，按最佳復(fù)合酶配比加入復(fù)合酶，設(shè)定超聲波功率為400 W，超聲溫度為50℃，采用5個(gè)提取時(shí)間（5，10，15，20，25 min）提取大蒜多糖，經(jīng)滅酶、過濾、離心后測定大蒜多糖含量，計(jì)算多糖得率。

1.5.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以多糖得率為指標(biāo)，以超聲功率、超聲溫度、液料比和提取時(shí)間4個(gè)因素為自變量，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理使用Design－Expert 8.0.5軟件，采用BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)四因素三水平共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

1.6 大蒜多糖的質(zhì)量測定

采用苯酚－硫酸法［20］測定總糖質(zhì)量，3，5－二硝基水楊酸法［21］測定還原糖質(zhì)量，按式（1）計(jì)算大蒜多糖質(zhì)量：

式中：

m1—— 多糖質(zhì)量，mg；

M1—— 總糖質(zhì)量，mg；

M2—— 還原糖質(zhì)量，mg。

1.7 大蒜多糖的得率測定

式中：

R—— 多糖得率，%；

m1—— 多糖質(zhì)量，mg；

m2—— 原料質(zhì)量（鮮重），mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.1.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方案 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的Box－Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，因素及水平見表1。

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析 為研究各工藝參數(shù)之間的交互作用對大蒜多糖得率的影響，按照表2的試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

以大蒜多糖得率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響用下列函數(shù)表示：

表1 Box－Behnken設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels in BBD

表2 43中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 43 Box－Behnken design and experimental data for the responses

對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance for quadric regression model

Prob＞F＜0.01極顯著＊＊；Prob＞F＜0.05顯著＊。

來源 平方和自由度 均方 F值 P值 顯著性模型 100.99 14 7.21 68.34 ＜0.000 1 ＊＊A 1.24 1 1.24 11.77 0.004 1 ＊＊B 1.03 1 1.03 9.72 0.007 6 ＊＊C 4.98 1 4.98 47.15 ＜0.000 1 ＊＊D 4.14 1 4.14 39.25 ＜0.000 1 ＊＊AB 0.87 1 0.87 8.26 0.012 3 ＊AC 8.95 1 8.95 84.78 ＜0.000 1 ＊＊AD 6.26 1 6.26 59.33 ＜0.000 1 ＊＊BC 0.090 1 0.090 0.86 0.370 7 BD 0.048 1 0.048 0.45 0.511 2 CD 3.77 1 3.77 35.69 ＜0.000 1 ＊＊A 2 16.06 1 16.06 152.20 ＜0.000 1 ＊＊B2 24.69 1 24.69 233.88 ＜0.000 1 ＊＊C2 18.99 1 18.99 179.93 ＜0.000 1 ＊＊D2 45.29 1 45.29 429.03 ＜0.000 1 ＊＊?dú)埐?1.48 14 0.11失擬項(xiàng) 1.12 10 0.11 1.26 0.443 6凈誤差 0.36 4 0.089校正項(xiàng) 102.47 28 R 2 0.985 6 Adj－R 2 0.971 2 Pred－R 2 0.931 5變異系數(shù)／% 1.41

由表3可知，模型R2＝0.985 6，表明方程的自變量A、B、C、D與響應(yīng)值Y之間線性關(guān)系擬合性較好。本試驗(yàn)所建模型中各單因素的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)中AB、AC、AD、CD均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其中 C、D、A2、B2、C2、D2、AC、AD、CD 達(dá) 到 極 顯 著 水平（P＜0.000 1）。（Adj－R2－Pre－R2）＜0.2，說明此模型準(zhǔn)確度高［23］，變異系數(shù)（C.V.）＜5%說明此模型的重現(xiàn)性較好［18］。綜合來看采用此回歸模型是合理的，可以用該方程預(yù)測不同提取條件下的大蒜多糖得率。

2.1.3 模型分析 通過響應(yīng)面三維圖可直觀地反映4個(gè)因素（超聲功率、超聲溫度、液料比和提取時(shí)間）的交互作用對大蒜多糖得率的影響，固定其中2個(gè)因素，繪制其余2個(gè)因素對響應(yīng)值影響的等高線圖和響應(yīng)面圖，見圖1～6。

圖1 超聲功率與超聲溫度的交互作用對大蒜多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 1 Response surface diagram and contour plot of correlative effects of ultrasonic power and ultrasonic temperature on garlic polysaccharides

圖2 超聲功率與液料比的交互作用對大蒜多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 2 Response surface diagram and contour plot of correlative effects of ultrasonic power and liquid to solid ratio on garlic polysaccharides

圖3 超聲功率與提取時(shí)間的交互作用對大蒜多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 3 Response surface diagram and contour plot of correlative effects of ultrasonic power and extraction time on garlic polysaccharides

圖4 超聲溫度與液料比的交互作用對大蒜多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 4 Response surface diagram and contour plot of correlative effects of ultrasonic temperature and liquid to solid ratio on garlic polysaccharides

圖5 超聲溫度與提取時(shí)間的交互作用對大蒜多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 5 Response surface diagram and contour plot of correlative effects of ultrasonic temperature and extraction time on garlic polysaccharides

圖6 液料比與提取時(shí)間的交互作用對大蒜多糖得率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Figure 6 Response surface diagram and contour plot of correlative effects of liquid to solid ratio and extraction time on garlic polysaccharides

由圖1～6可知，在所選的兩因素范圍內(nèi)響應(yīng)面圖存在最高點(diǎn)，即大蒜多糖得率極值。

2.2 優(yōu)化工藝參數(shù)的驗(yàn)證

據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)化分析，得到預(yù)測最佳工藝條件：超聲功率408.92 W，超聲溫度49.51℃，液料比7.6∶1（V∶m），提取時(shí)間15.86 min，此時(shí)大蒜多糖的得率為26.39%。由于試驗(yàn)條件無法完全按照優(yōu)化條件進(jìn)行，故稍加修改：超聲功率400 W，超聲溫度49.5℃，液料比7.6∶1（V∶m），提取時(shí)間16 min，重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3次，此時(shí)大蒜多糖的平均得率為26.12%。在顯著性水平P＜0.05前提下，預(yù)測值與實(shí)際值無顯著性差異。預(yù)測值和真實(shí)值之間有很好的擬合性，說明了此模型的可靠性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用響應(yīng)面Box－Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化了超聲復(fù)合酶法提取大蒜多糖的最佳工藝條件，建立了提取大蒜多糖的參數(shù)方程，由響應(yīng)面試驗(yàn)確定的較適宜提取工藝為超聲波功率400 W，超聲溫度49.5℃，液料比7.6∶1（V∶m），提取時(shí)間16 min，在此優(yōu)化工藝條件下多糖得率為26.12%，與模型預(yù)測值基本一致，比傳統(tǒng)熱水提取多糖得率［19］（鮮蒜的多糖得率15.05%）提高了74%，大大縮短了提取時(shí)間（傳統(tǒng)熱水浸提法為205.48 min，本試驗(yàn)僅為16 min）。

此外，本試驗(yàn)將超聲波與復(fù)合酶共同作用應(yīng)用到大蒜多糖的提取，結(jié)果顯示大蒜多糖得率明顯高于傳統(tǒng)水提法和復(fù)合酶提取法，但其機(jī)理尚不明確，目前報(bào)道的也只是一些猜測性的理論［24，25］，需要進(jìn)行研究和論證。

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