劉曉軍 蔡玉文 胡 強 鄭冬云

LIU Xiao－jun CAI Yu－wen HU QiangZHENG Dong－yun

（中南民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，湖北 武漢 430074）

（College of Biomedical Engineering，South－central University for Nationalities，Wuhan，Hubei 430074，China）

亞硝酸鹽是許多國家允許使用的食品添加劑，不但能使食品的色澤鮮艷，還能防腐。但長期大量食用含有亞硝酸鹽的食物，可對人體的健康構(gòu)成潛在的威脅，可引起食管癌、胃癌、肝癌和大腸癌。此外，許多研究［1－3］表明：亞硝酸鹽可能與人類先天畸形的發(fā)生有關(guān)，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天畸形高發(fā)的重要原因之一。而中國是出生缺陷高發(fā)國家，中國北方廣大地區(qū)是屬于世界上神經(jīng)管畸形發(fā)生率最高的地區(qū)，而這些高發(fā)地區(qū)與該地區(qū)食物中較高的亞硝酸鹽含量密切相關(guān)［4－6］。因此，實現(xiàn)食品中亞硝酸鹽含量的準(zhǔn)確測定是一個備受關(guān)注的研究課題。

1 亞硝酸鹽的檢測方法

由于亞硝酸鹽在堿性環(huán)境中容易被氧化，在酸性介質(zhì)中易形成HNO2，再進(jìn)一步分解。并且它既具有氧化性又具有還原性，在檢測過程如果遇到氧化還原性物質(zhì)可能形成干擾，這就對檢測方法的選擇性和靈敏度提出了不小的挑戰(zhàn)。目前根據(jù)NO、NO、NO等含氮化合物之間可發(fā)生的反應(yīng)和相互轉(zhuǎn)化（見圖1）［7］，探究出了許多亞硝酸鹽的檢測方法，常見的有紫外光度法、熒光光度法、高效液相色譜法、離子色譜法、毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)法等。

圖1 含氮化合物之間相互轉(zhuǎn)化常見的反應(yīng)途徑Figure 1 The common reactions between nitrogen compounds

1.1 光度法

1.1.1 紫外可見光度法 Griess反應(yīng)分析法［8］是目前國內(nèi)外普遍使用也是最早發(fā)現(xiàn)的檢測亞硝酸鹽的方法。Griess反應(yīng)分析法是在酸性條件下，將NO與Griess試劑中的對氨基苯磺酸反應(yīng)，生成重氨鹽（見圖1中路線②），然后再與N－（1－萘基）－乙二胺偶聯(lián)生成紅色染料（見圖2）。該染料在543 nm處有最大吸收，可以用光度法進(jìn)行測定。Griess法的檢測限可達(dá)到0.02～2μM，而且具有很高的靈敏度。然而，該反應(yīng)所需試劑本身都是毒性很大的致癌物質(zhì)，并且顯色反應(yīng)的穩(wěn)定性比較差，同時測定 Cu2＋、Fe2＋、S2－、I－等都有干擾。該方法的優(yōu)點是回收率高，重現(xiàn)性好，而且操作簡便，適應(yīng)于生產(chǎn)單位常規(guī)測定，但在復(fù)雜介質(zhì)中測定會受到影響。

圖2 紫外可見光度法檢測亞硝酸鹽Figure 2 The detection of nitrite use ultraviolet－visible spectrophotometry

張妮［9］根據(jù)Fe2＋可以被亞硝酸鹽顯著氧化的特性，利用紫外可見分光光度法建立了一種可測定香腸中亞硝酸鹽的催化動力學(xué)的新方法。該方法測定的最優(yōu)化條件：Fe2＋初始濃度0.002 mol／L，Cl－濃度0.04 mol／L，苯酚初始濃度0.064 mol／L，測 定 波 長 480 nm，p H 值 2.5，反 應(yīng) 時 間50 min，反應(yīng)溫度25℃。此條件下，該方法的線性范圍為0.1～1.2μg／m L，回收率為95%～98.5%。結(jié)果表明，該方法選擇性、準(zhǔn)確度和精密度比較高，干擾比較小，可準(zhǔn)確的測定香腸中亞硝酸鹽的含量。

1.1.2 熒光光度法 該法是通過檢測各種能與亞硝酸根反應(yīng)，形成一種具有熒光發(fā)光性質(zhì)的化合物，來檢測亞硝酸鹽。據(jù)Lapat等［10］報道，2－氨基－4－氯－6－磺酸苯酚和4－氨基熒光素均能與亞硝酸根反應(yīng)，生成具有熒光發(fā)光性質(zhì)的化合物（見圖3）。該化合物可在608 nm（495 nm激發(fā)）和518 nm（492 nm激發(fā)）下有強烈的熒光發(fā)光信號。該方法的優(yōu)點是靈敏度高、取樣量少、線性范圍寬，可以有效地檢測NO，且不受檢測液本身顏色和渾濁的干擾，也不受樣品稀釋度的影響，但是操作較為復(fù)雜，對環(huán)境因素敏感，適用范圍窄。

圖3 熒光光度法檢測亞硝酸鹽Figure 3 The detection of nitrite use fluorescence spectrophotometry

黃克靖等［11］以石墨烯為吸附劑，制備固相萃取柱，建立了一種測定亞硝酸鹽的新型熒光光譜法。該方法以8－（3′，4′－二氨基苯）－二氟化硼－二吡咯甲烷為熒光探針，在溫度為30℃的酸性條件下，與亞硝酸根反應(yīng)15 min后，生成了熒光衍生產(chǎn)物。經(jīng)固相萃取該衍生產(chǎn)物后，采用熒光光度法測定。該法的線性范圍在0.2～200 nmol／L。當(dāng)信噪比等于3時，該方法的檢出限為0.08 nmol／L。將該方法用在肉類和蔬菜中測亞硝酸鹽含量，加標(biāo)回收率為94.0%～110.4%。該方法具有選擇性好，靈敏度高，檢測快速等優(yōu)點。

1.2 色譜法

1.2.1 高效液相色譜法 該法是以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，各成分在柱內(nèi)被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而達(dá)到對試樣的分析。高效液相色譜法具有高效、高速、靈敏度高、操作方便等優(yōu)點。吳富忠等［12］建立了一種蔬菜、水果及其制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的高效液相色譜同時測定的方法。該方法通過樣品中亞硝酸鹽與硝酸鹽用超純水浸提，經(jīng)活性炭脫色后過濾，濾液經(jīng)0.45μm水相膜過濾后進(jìn)樣，在Phenomnenex SAX色譜柱上，以0.01 mol／L磷酸二氫鉀為流動相進(jìn)行分離，205 nm檢測，外標(biāo)法定量。該方法最低檢出量分別是亞硝酸鹽氮0.1 mg／kg，硝酸鹽氮0.07 mg／kg。樣品加標(biāo)回收率，亞硝酸鹽為91.0%～101.9%，硝酸鹽為94.7%～106.0%，RSD＜5%。該方法速度快，干擾少，結(jié)果準(zhǔn)確，操作較簡單，靈敏度高，可用于蔬菜、水果及其制品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定。

1.2.2 離子色譜法 該法是液相色譜法的一種，主要是將試樣進(jìn)行沉淀，再采取相應(yīng)方法進(jìn)行提取和凈化，利用離子交換原理，連續(xù)對各種離子進(jìn)行定量和定性的分析。蔡薈梅等［13］建立了一種離子色譜法測定茶葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的分析方法。該方法是將樣品通過超聲提取后，用PVPP吸附和固相萃取柱凈化的方法進(jìn)行前處理，經(jīng)高容量陰離子交換柱分離，用抑制型電導(dǎo)檢測器進(jìn)行檢測。該方法樣品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的回收率范圍分別為88.6%～107.5%和89.3%～101.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.67%和1.13%。該方法測定硝酸根和亞硝酸根具有操作簡便、準(zhǔn)確性高、測定快捷的優(yōu)點。

目前幾乎所有的色譜方法都已被用于研究亞硝酸鹽的檢測。通過對樣品的預(yù)處理后，再進(jìn)行直接檢測或是將樣品衍生化后間接測定，這是色譜分析方法檢測硝酸鹽的主要思路。還有一種常用的樣品衍生化方法是用過氧化氫將NO氧化成NO，然后再與含活性芳環(huán)的試劑如2，4－二甲基苯酚［14］和1，3，5－三甲氧基苯［15］等進(jìn)行硝基化反應(yīng)把NO轉(zhuǎn)化成親電的NO來進(jìn)行檢測。另一種方法是通過鹵代烷烴的親核取代反應(yīng)將亞硝酸根轉(zhuǎn)化成硝基化合物。五氟溴苯（PFB）即可將亞硝酸根轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的硝基化合物［16］。GCMS結(jié)果顯示（見圖4），既能看到NO的分子離子峰，又能看到微弱的甲基－硝基鍵的斷裂。除了與質(zhì)譜聯(lián)用，將色譜分離技術(shù)與紫外［17］、熒光［18］、電化學(xué)分析［19］等 檢測手段聯(lián)用，均可達(dá)到有效檢測亞硝酸根的目的。

1.3 毛細(xì)管電泳法

與上述方法相比，毛細(xì)管電泳法的突出優(yōu)勢在于可以實現(xiàn)自動化控制的快速、同時檢測并且試劑用量比較少，分析化合物種類廣泛。Merusi等［20］建立了一種可以同時測定硝酸根、亞硝酸根和草酸根的新型毛細(xì)電泳法。該方法采用烙融石英毛細(xì)管柱（75μm ×32.5 cm，有效長度為21.5 cm）作為分離通道，以50μM磷酸鹽（p H＝2.5）作為運行緩沖液，毛細(xì)管柱溫25℃，運行電壓25 k V，檢測波長214 nm，進(jìn)樣壓力3.5 k Pa，外標(biāo)法定量測定。該方法亞硝酸鹽、硝酸鹽和草酸鹽的檢測限分別為0.8，0.3，4.5 mg／L，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。該方法適用于測定蔬菜硝酸根、亞硝酸根和草酸根的含量。

圖4 通過五氟溴苯的親核取代反應(yīng)來檢測亞硝酸鹽的GC－MS方法Figure 4 The detection to nitrite method of GC－MS through five fluorine bromobenzenenucleophilic substitution reaction

姜廷福等［21］在測定腌菜中的硝酸根和亞硝酸根時，是以溴離子為內(nèi)標(biāo)，建立了一種毛細(xì)血管離子電泳同時測定的方法。討論了緩沖溶液的p H值、樣品和緩沖溶液NaCl濃度、分離電壓對分離的影響。該方法在緩沖溶液為p H＝3.5作為背景電解質(zhì)條件下，硝酸根和亞硝酸根的檢出限分別為0.01，0.03 mg／kg。

1.4 電化學(xué)傳感法

1.4.1 電位型傳感器 電位型傳感器是將溶解在電解質(zhì)溶液中的離子作用于離子電極而產(chǎn)生的電動勢作為檢測對象，從而實現(xiàn)對離子的檢測。目前研究最多的是離子選擇性電極，它能以電極電位形式指示溶液中特定離子的活度。因其具有結(jié)構(gòu)簡單、靈敏度好、選擇性高、響應(yīng)速度快、易于攜帶等特點，可以有效地檢測低濃度的亞硝酸鹽。從早期的PVC膜［22］到現(xiàn)在廣 泛 使 用 的 TDABr膜［23］、TDAN 膜［24］均 可 以作為離子交換膜，與可作為增塑劑的二丁基鄰苯二甲酸鹽（DBP）、o－硝基苯辛基醚（o－NPOE）［25］結(jié)合使用可以制得性能優(yōu)良的亞硝酸根離子選擇性電極。

1.4.2 電流型傳感器 電流型傳感器是保持電極和電解質(zhì)溶液的界面為一恒定電位，將被測物質(zhì)直接氧化或者還原，檢測流過外電路的電流從而實現(xiàn)對亞硝酸鹽的檢測。早在20世紀(jì)初人們便廣泛地研究不同材料的電極對亞硝酸根的響應(yīng)，如銅電極、鉑電極、金電極、銀電極、玻碳電極、鉛電極等等。但由于在這些裸電極上電子傳遞速度慢［26］，氧化亞硝酸根所需的過電勢較高，大大影響了傳感器的選擇性和靈敏度。

隨著化學(xué)修飾電極的問世，人們研究了各種可以有效地電催化氧化亞硝酸根的電極表面修飾方法。采用合適的金屬離子如 Cu（II）、Cu／Cd合金［27］等電沉積到電極表面，可以增大電極的活性表面積，降低反應(yīng)所需的過電勢。這種方法的最大優(yōu)點是可以不依賴于原先的電極材料而使得亞硝酸根在沉積的金屬層表面發(fā)生氧化還原。很多復(fù)雜的金屬配合物也作為電極修飾材料被應(yīng)用于亞硝酸的電化學(xué)催化［28］。馮 珍 鴿 等［29］根 據(jù) 此 制 備 了 基 于 磷 鎢 雜 多 酸 鹽（Na3PW12O40）的多層膜電化學(xué)傳感器，實現(xiàn)其對腌制食品中亞硝酸鹽含量的快速檢測。該方法用層接層法（layer－bylayer）將 Na3PW12O40和 PAH 交 替 沉 積 于 以 （PEI／PSS／PAH）為底層的ITO電極上，制得多層膜亞硝酸鹽傳感器，分析該傳感器的電化學(xué)性質(zhì)，并利用其在溶液中對亞硝酸根的安培傳感，測定腌制食品中亞硝酸鹽含量。該方法制備的傳感器在亞硝酸鹽濃度為1.67×10－8～3.23×10－6mol／L時 呈 現(xiàn) 良 好 的 線 性 關(guān) 系，I（μA）＝ 0.125＋ 0.630c（μmol／L），R ＝0.999 2（n＝10），響應(yīng)電流達(dá)到95%時所需時間小于3 s。

采用生物催化劑，如還原酶等修飾電極可以顯著地提高電極的選擇性和靈敏度，檢測時間也較短。Zhao等［30］制得的基于硝化桿菌制備的生物傳感器可以在含氧的環(huán)境下完成對亞硝酸鹽的檢測。然而，此類傳感器生產(chǎn)成本較高，制備過程復(fù)雜，不適宜廣泛地開發(fā)使用。

近些年來，有機染料修飾電極也被用于檢測亞硝酸鹽。Zuther等［31］利用在玻碳電極表面電聚合燦爛甲酚藍(lán)的方法制備的修飾電極可以在9×10－7～1.49×10－5mol／L濃度范圍內(nèi)對亞硝酸鹽進(jìn)行檢測，檢測限達(dá)1.0×10－8mol／L。將該傳感器應(yīng)用于肉類、腌菜中亞硝酸鹽的檢測也取得了令人滿意的效果。

2 總結(jié)與展望

食品中亞硝酸鹽的檢測方法種類繁多，各有利弊。通過對比筆者認(rèn)為，電化學(xué)傳感法具有更廣闊的發(fā)展前景。因為它不僅具有儀器簡單，操作方便，分析速度快等優(yōu)點，而且具有靈敏度高，便于與計算機聯(lián)機自動化等特點。它不受檢測溶液顏色的影響，克服了光度法的一些不足，且穩(wěn)定性較好，加之新型納米復(fù)合材料的修飾使亞硝酸鹽電極的電流響應(yīng)成千上萬倍的提高，還有酶的修飾顯著地提高了電極的選擇性，增強了其傳感器的綜合性能。但目前這些電化學(xué)傳感器應(yīng)用在測定亞硝酸根的研究還處在探索改進(jìn)階段，測量食品中的亞硝酸鹽電化學(xué)傳感器的研究現(xiàn)在還存在線性范圍窄、離子干擾等問題，尤其是化學(xué)修飾電極的研究還處在試驗階段。相信通過科學(xué)工作者的努力，深入研究電化學(xué)傳感器測定亞硝酸根的機理，將會研究出更多選擇性更好，檢測精密度和準(zhǔn)確度更高的電化學(xué)傳感器。

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