丁仁君 夏延斌

DING Ren－junXIA Yan－bin

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128）

（College of Food Science and Technology，Hunan Agriculture University，Changsha，Hunan 410128，China）

葡萄酒作為人類較早的酒精飲料之一，有著悠久的歷史和文化底蘊(yùn)。考古發(fā)現(xiàn)人類在1萬年前的新石器時代就開始采集野生葡萄果實鮮食及釀造葡萄酒［1］。在中國的歷史長河中，葡萄酒一直是作為皇宮貴族的飲品，在唐宋鼎盛時期，民間也有自釀自飲葡萄酒的風(fēng)氣。根據(jù)中國著名的醫(yī)典《本草綱目》記述，葡萄酒有“暖腎腰、駐顏色、耐寒”等神奇功效。由此可見，古人對葡萄酒的獨(dú)到認(rèn)識和喜愛。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，西方營養(yǎng)學(xué)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)了葡萄酒中更多的秘密和獨(dú)特作用。葡萄酒對人體有益的物質(zhì)多達(dá)上百種，如各種有機(jī)酸、酚類、維生素、礦物質(zhì)等等。雖然有些物質(zhì)含量不高，但被人體吸收利用率極高。為深入了解葡萄酒的保健功能，科學(xué)技術(shù)人員還開展了較多的動物和人體試驗。發(fā)現(xiàn)葡萄酒中的白藜蘆醇具有抑制腫瘤［2］、保護(hù)心血管［3－5］、抗氧化［6］、清除自由基、預(yù)防糖尿病性心肌?。?］等功效；葡 萄 酒 中 的 花 色 苷，具 有 抗 癌［8，9］、降 血 脂［10］、抗氧化［11，12］、抗炎［13］等功效。葡萄酒中的有機(jī)酸能反映葡萄原料的特性和酒的風(fēng)味特性，也能反映釀造工藝的特點，因此近年來相關(guān)研究越來越多。

1 葡萄酒中的有機(jī)酸種類及其對風(fēng)味的影響

葡萄酒的釀造過程是酵母菌將葡萄中的糖類轉(zhuǎn)化為酒精的過程，整個過程中有多達(dá)幾十種有機(jī)酸參與反應(yīng)，主要有以下種類。

1.1 酒石酸（tartaric acid）

2，3－二羥基丁二酸，在葡萄果實中大量存在，在成品酒中的含量為1.5～2.5 g／L。酒石酸的酸性很強(qiáng)，最容易解離，所以酒體的p H受酒石酸含量的影響很大。在葡萄酒發(fā)酵初期，為抑制雜菌的生長，常常會人為的用葡萄汁將酒石酸溶解，然后加入到發(fā)酵容器中，使整體的p H值降低，而促進(jìn)正常的酒精發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，由于細(xì)菌的新陳代謝，酒石酸會被消耗掉一部分，而其他的酒石酸會部分轉(zhuǎn)變成酒石酸鹽沉淀［14］。葡萄酒中的酒石酸含量過高時，酒味會變的粗硬，有澀斂感，從而降低葡萄酒的品質(zhì)［1］。

1.2 蘋果酸（malic acid）

2 －羥基丁二酸，在自然中有D－、L－、DL－3種存在形式，成品酒中的含量為1.5～3.0 g／L。水果中絕大部分含有L－蘋果酸，隨著成熟度的提高，其含量會慢慢降低。在葡萄酒釀造時，當(dāng)酒精發(fā)酵基本結(jié)束后，會進(jìn)入蘋果酸－乳酸發(fā)酵（MLF）階段，即在乳酸菌的作用下，將L－蘋果酸分解為L－乳酸和CO2的過程。對于整個酒體來說，降低了酸澀度，粗糙度和色度等，該發(fā)酵過程生成的醛類、酯類等能很好的修飾酒的風(fēng)味，對于酒的品質(zhì)形成不可或缺。p H升高的同時，可降低生酒的生青味和苦澀感，能使酒體更柔和、圓潤［15］。目前，已經(jīng)可以通過一些人工的手段對MLF過程進(jìn)行干擾或調(diào)控，以達(dá)到理想的葡萄酒風(fēng)味和穩(wěn)定性［16］。

1.3 檸檬酸（citric acid）

2 －羥基丙烷－1，2，3－三羧酸，有溫和爽快的酸味，在成品酒中的含量為0.10～0.15 g／L。在各種葡萄果實中均含有檸檬酸，但因釀造工藝不同，不同種類葡萄酒中的檸檬酸含量差別很大。在TCA循環(huán)中檸檬酸僅是中間產(chǎn)物，最終被消耗掉。而在蘋果酸－乳酸發(fā)酵的過程中，乳酸菌在同時分解消耗檸檬酸，產(chǎn)生呈香物質(zhì)雙乙酰（2，3－丁二酮）及其衍生物2，3－丁二醇等，所以紅葡萄酒的釀造中幾乎耗掉所有的檸檬酸。

1.4 乳酸（lactic acid）

2 －羥基丙酸，有D－、L－型兩種，成品酒中的含量為0.18～0.40 g／L。乳酸的主要來源是酒精發(fā)酵和 MLF發(fā)酵，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生D－乳酸，MLF發(fā)酵形成L－乳酸。乳酸的酸味很強(qiáng)，但酸味較溫和。如果釀造過程中未被細(xì)菌污染，其在葡萄酒中的含量不會太高。

1.5 乙酸（acetic acid）

又名醋酸，具有很強(qiáng)烈的酸味，是酵母菌發(fā)酵的常規(guī)代謝產(chǎn)物，主要在發(fā)酵初期產(chǎn)生，是酒類中主要的揮發(fā)酸，在酒體中的含量低于0.4 g／L。乙酸可與乙醇形成酒的特征香味物質(zhì)——乙酸乙酯。在發(fā)酵后期或陳釀過程中，如果未能很好的隔絕氧氣或被其他細(xì)菌污染，大量乙醇就會轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜幔f明酒體已酸敗變質(zhì)。

1.6 琥珀酸（succinic acid）

即丁二酸，在成品酒中的含量為0.6～1.5 g／L。在酵母菌發(fā)酵的過程中，經(jīng)三羧酸循環(huán)均會代謝產(chǎn)生琥珀酸；MLF過程中，蘋果酸會轉(zhuǎn)化為琥珀酸；還有一部分來自谷氨酸的轉(zhuǎn)化。琥珀酸的味感復(fù)雜，有酸味又有苦味，參與酒味的形成。由于各地的氣候、葡萄品種、土壤等差異，導(dǎo)致葡萄原料中的C源、N源含量不同，所以各地區(qū)的葡萄酒中琥珀酸含量差別較大。

1.7 富馬酸（fumaric acid）

又名延胡索酸，反丁烯二酸，是檸檬酸三羧酸循環(huán)中的中間代謝產(chǎn)物之一，由蘋果酸脫去一個水或琥珀酸經(jīng)脫氫酶作用形成。富馬酸的酸味純正，酸感強(qiáng)，但在葡萄酒中的含量極低，對酒的酸味影響很小。

1.8 丙酮酸（pyruvic acid）

又叫2－氧代丙酸，是糖酵解過程中，磷酸烯醇丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下，生成丙酮酸；丙酮酸在脫羧酶、脫氫酶的作用下，先轉(zhuǎn)變成乙醛，再轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖?。葡萄酒中的丙酮酸含量不高，約為0.05～0.10 g／L［14］，大部分被分解，對整體風(fēng)味無顯著的影響。

1.9 乙醛酸（glyoxylic acid）

在乙醛酸循環(huán)中，異檸檬酸在裂解酶的作用下生成，還有一部分是由甘氨酸在氧化酶的作用下形成。乙醛酸有不愉快的香味，但在整個發(fā)酵中，其僅是中間代謝產(chǎn)物，在最終的葡萄酒中乙醛酸含量極低，故其對整體的風(fēng)味影響可以忽略。

1.10 其他

除此之外，葡萄酒中還有α－酮戊二酸、草酸、莽草酸、糖醛酸、葡萄糖酮酸、半乳糖二酸等多種有機(jī)酸，這些酸在葡萄酒中的含量微乎其微，對酒的風(fēng)味影響不大。

2 有機(jī)酸的檢測方法

隨著色譜技術(shù)的成熟和推廣，食品中有機(jī)酸的測定技術(shù)得到了快速發(fā)展。GB／T 15038－2006［17］葡萄酒、果酒通用分析方法中規(guī)定了HPLC法測定有機(jī)酸的方法，盡管該標(biāo)準(zhǔn)僅發(fā)布幾年，但其方法的局限性很明顯，如，前處理中要進(jìn)行固相萃取柱的活化、洗脫并收集樣品，才能進(jìn)行測定，甚為繁瑣。學(xué)者們更希望有簡便、快速的檢測方法，所以在國標(biāo)的基礎(chǔ)上，對前處理方法、檢測條件等進(jìn)行優(yōu)化，獲得了一些較好的成果。

2.1 RP－HPLC法

液相色譜檢測葡萄酒中的有機(jī)酸占利用色譜技術(shù)檢測有機(jī)酸的70%以上，準(zhǔn)確率、重復(fù)性、便捷性均優(yōu)于其他檢測方法。表1是液相色譜法檢測有機(jī)酸的方法比較。

根據(jù)表1所列方法，可以歸納出RP－HPLC法檢測葡萄酒中有機(jī)酸的要點：流動相需經(jīng)0.45μm濾膜過濾脫氣后方可使用；經(jīng)發(fā)酵、陳釀后，大部分有機(jī)酸已經(jīng)轉(zhuǎn)移到酒體中，故樣品經(jīng)離心或不離心，稀釋定容后過0.45μm微膜，方可上機(jī)檢測。色譜條件：配VWD檢測器，ODS或性能相當(dāng)?shù)纳V柱，250×4.6 mm，5μm，檢測波長210 nm，柱溫25～30℃，流速0.6～0.8 mL／min，進(jìn)樣5或10μL（視機(jī)器而定），以0.01 mol／L的磷酸鹽緩沖液，p H 2.7～3.0的 K2HPO4或（NH4）2HPO4溶液作流動相進(jìn)行檢測，在這些基本條件下各種酸的分離度、相關(guān)系數(shù)、回收率都較高。如胡小露等［25］進(jìn)行9種有機(jī)酸的精密度試驗，平均RSD可達(dá)0.15%（n＝6）；進(jìn)行重復(fù)性試驗，平均RSD可達(dá)0.35%（n＝6）；加標(biāo)回收率試驗，平均回收率為99.52%，平均 RSD為0.019%（n＝5）；發(fā)酵結(jié)束后，每隔10 d連續(xù)取樣4次進(jìn)行測定，也未出現(xiàn)雜峰對目標(biāo)物質(zhì)的干擾。其他學(xué)者的回收率也都較高，由此可見，RP－HPLC法測葡萄酒中的有機(jī)酸，安全、快速、可靠，而且操作簡便，是檢測有機(jī)酸的首推方法。

2.2 其他色譜檢測方法

2.2.1 衍生化氣相色譜法 氣相色譜使用成本較低，且對環(huán)境相對友好。杜曦等［27］通過酯化方法的比較，篩選出碘乙烷衍生化處理方法，用福力GC9790氣相色譜儀，SP－30毛細(xì)管柱，程序升溫法，同時測定了葡萄酒中的丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、戊二酸、酒石酸、己二酸、檸檬酸，分析時間16 min。各種酸的分離度很好，且回收率可達(dá)95.1%～98.9%。

表1 不同的液相色譜方法檢測葡萄酒中的有機(jī)酸Table 1 Different method for organic acids testing in wine

表1 不同的液相色譜方法檢測葡萄酒中的有機(jī)酸Table 1 Different method for organic acids testing in wine

T.酒石酸；M.蘋果酸；L.乳酸；A.乙酸；C.檸檬酸；F.富馬酸；S.琥珀酸；O.草酸；As.抗壞血酸；I.異檸檬酸；Sh.莽草酸；－.未提及。

文獻(xiàn)樣品前處理色譜儀 柱子型號 流動相流速／（m L·min－1）柱溫／℃檢測波長／nm酸的種類分析時間／min進(jìn)樣量／μL GB／T 15038 過固相萃取柱 －Fetigsaule T 300－7，8 0.007 5 mol／L H 2 SO4溶液0.3 55 210 T，M，L，A，C，S－ 20［18］皂土處理，活性炭吸附后，微膜過濾Waters 600E Bio－Rad HP×87－H，300×7.5 mm，9μm 0.1%磷酸水溶液 0.7 55 192 C，T，M，S，L，A－ 5［19］ 離心后微膜過濾島津LC－3A SCR－101H300×7.9 mm高氯酸調(diào)的p H 2.5 H 2 O溶液0.6 55 210 C，T，M，S，L，A 16 10［20］ 直接微膜過濾日立638－50 Hypersil 250×4.0 mm，10μm p H 2.75 0.01 mol／L（NH 4）2 HPO4 0.6 25 210 T，M，L，C，S 14 15［21］ 微膜過濾兩次Waters 600E Shodex Rspak Kc－811 0.1%磷酸水溶液 0.5 65 206 C，T，M，S，L，A 16 5［22］ 離心后微膜過濾 島津VP－ODS C18，150×4.6 mm p H 3.0 0.01 mol／L H 3 PO4－KH 2 PO4 1.0 30 215 T，M，C，S 6 －［23］將葡萄破碎后加水超聲提取、稀釋，再微膜過濾福立FL2200ⅡUltimate XB－C18，250×4.6 mm，5μm p H 2.0 0.01 mol／L K2 HPO4，K2 HPO4∶CH 3 OH＝97∶3 0.5 25 210 T，M，As，L，A，C 19 20［24］ 水浴震蕩、離 心后，微膜過濾［25］ 直接微膜過濾Agilent 1200 Waters 600 Kromasil C18，250×4.6 mm，5μm Waters symmetry C18，250×4.6 mm，5μm p H 2.8 0.01 mol／L KH 2 PO4，KH 2 PO4∶CH 3 OH＝97∶3 p H 2.0 4 g／100 m L（NH 4）2 HPO4 0.8 25 210 1.0 室溫 210 O，T，M，As，C O，T，M，I，Sh，L，A，C，S 8 10 11 5［26］ 離心后直接微膜過濾Agilent 1200 Ultimate TM AQ－C18 250×4.5 mm，4.5μm p H 2.85 0.01 mol／L（NH 4）2 HPO 4 0.8 30 210 T，M，L，A，C，F(xiàn)，S 15 10

2.2.2 單柱離子排斥色譜法 離子排斥色譜是離子色譜法的一個重要分支，是分離有機(jī)酸的常用方法。徐繼明［28］用島津LC－10AS離子色譜儀，CDD－6A 電導(dǎo)檢測器，TSKgel OApak－A色譜柱，p H 3.4 2 mmol／L苯甲酸溶液作流動相，流速1.0 m L／min，進(jìn)樣25μL，電導(dǎo)檢測器1μS／cm，柱溫25℃±2℃，分析時間14 min，可同時對葡萄酒中的酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、甲酸、乙酸、琥珀酸進(jìn)行測定。分離時間較短，相對偏差為1.8%～3.6%，回收率為97.9%～105.6%。

2.2.3 HPLC－PDA 法 Yan－jun Zheng等［29］直接將葡萄原汁或葡萄酒離心，稀釋后直接經(jīng)0.22μm濾膜過濾，用液相色譜二極管陣列檢測法（HPLC－PDA）進(jìn)行檢測，可同時測定草酸、酒石酸、丙酮酸、L－蘋果酸、L－抗壞血酸、L－乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸9種有機(jī)酸。色譜條件為Waters系列色譜儀，Waters－2695XE四元泵，Waters－2996 PDA 檢測器，Waters Atlantis dC18色譜柱（150×4.6 mm，5μm），流速1.0 m L／min，進(jìn)樣10μL，檢測波長為抗壞血酸243 nm，其他酸210 nm，柱溫30℃，p H 2.7的0.01 mol／L KH2PO4∶乙腈＝95∶5，檢測時間小于13 min，可使大部分有機(jī)酸得到良好分離。

楊東偉等［30］用固相萃?。咝б合嗌V－光電二極管陣列檢測法（SPE－HPLC－PDA），同時對葡萄酒中的11種有機(jī)酸進(jìn)行檢測，分別為草酸、乙酸、丙烯酸、琥珀酸、丙二酸、酒石酸、富馬酸、檸檬酸、丙酸、蘋果酸、乳酸。用Agilent 1100液相色譜儀，配二極管陣列檢測器，Hypersil C18色譜柱（250×4.6 mm，5μm），流速1.0 m L／min，進(jìn)樣20μL，檢測波長210 nm，柱溫25℃，甲醇和0.5%磷酸水溶液作流動相，用梯度洗脫法，分析時間15 min。該法分析時間較短，且同時檢測的有機(jī)酸種類多，分離度好。

2.2.4 RP－HPLC－CL法 吳永平等［31］用液相色譜－化學(xué)發(fā)光分析方法（RP－HPLC－CL）對葡萄酒中的蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸3種有機(jī)酸進(jìn)行了分析。用葡萄酒用濾紙過濾后稀釋，再微膜過濾即可進(jìn)行檢測。色譜條件：島津LC－6A液相色譜儀，k BPCL超微弱發(fā)光測量儀，依利特Hypersil ODS 25μm，4.6×150 mm，流動相為p H 2.5的 HClO4溶液，流速0.8 m L／min，進(jìn)樣20μL，柱溫為室溫。分析時間僅8 min，但只能檢測3種有機(jī)酸。

2.2.5 液相指紋圖譜法 指紋圖譜技術(shù)是近十幾年來一種發(fā)展快速的對復(fù)雜物質(zhì)的研究方法，已廣泛應(yīng)用于中草藥等天然產(chǎn)物鑒定及其質(zhì)量控制中。葡萄酒有天然屬性，但有類似中藥的復(fù)雜體系，故用此方法可提供豐富的鑒別信息。辛若竹等［32］用液相色譜建立有機(jī)酸指紋圖譜，即用山葡萄酒建立指紋圖譜庫，有15個特征峰，對應(yīng)15種有機(jī)酸，再將樣品與指紋圖譜進(jìn)行對比，以確認(rèn)是否為人工勾兌葡萄酒。用島津LC 20AT液相色譜儀，Shimpack VP－ODS 色譜柱（250×4.6 mm，5μm），p H 2.9 0.02 mol／L KH2PO4溶液，KH2PO4∶CH3OH＝98∶2，流速1.0 m L／min，進(jìn)樣20μL，檢測波長210 nm，柱溫30℃，分析時間60 min。此法可很好的用來鑒別葡萄酒的真?zhèn)渭霸俊?/p>

2.2.6 離子色譜法 離子色譜－電導(dǎo)檢測法，是種新型的檢測手段，電導(dǎo)檢測器可以分析混合物中的常量、痕量陰陽離子。李 芳 等［33］用 Dionex ICS－2000 離 子 色 譜 儀，4 mm AS11－HC分離柱，2～40 mmol／L NaOH 溶液作梯度洗脫液，淋洗流速1.0 m L／min，進(jìn)樣25μL，同時對葡萄酒中的乳酸、丙酸、丁酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸6種有機(jī)酸進(jìn)行了檢測，分析時間33 min。

張斯等［34］用 Dionex ICS－1500離子色譜儀，IonPac AS11（250×4 mm）分析柱，0.2～25 mmol／L KOH 溶液作梯度洗脫液，淋洗流速1.0 m L／min，進(jìn)樣25μL，色譜池溫度35℃，柱溫30℃，控制電流100 m A，對進(jìn)口葡萄中的9種有機(jī)酸同時進(jìn)行了檢測，分別為乳酸、乙酸、丙烯酸、山梨酸、苯甲酸、蘋果酸、酒石酸、富馬酸、檸檬酸，不僅有葡萄酒本來就含有的有機(jī)酸，還有人工添加的作防腐劑的酸。

2.2.7 雙柱高效液相色譜法 張會寧等［35］用雙小柱高效液相色譜法對葡萄及葡萄酒中的有機(jī)酸進(jìn)行了檢測，可同時檢測8種有機(jī)酸。用安捷倫LC 1260液相色譜儀，色譜柱HYPERSIL 150×4.6 mm，5μm，流動相為70 g／L的磷酸氫二鉀和14 g／L的硫酸銨定溶至1 000 m L，用硫酸調(diào)整p H值至2.1，流速0.8 m L／min，柱溫20℃，檢測波長210 nm，進(jìn)樣10μL。葡萄酒膜過濾后上機(jī)測試，檢測時間14 min，各有機(jī)酸的相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.999 7以上。

3 問題與展望

葡萄酒中有機(jī)酸的檢測盡管方法很多，但存在檢測結(jié)果誤差大，不同檢測方法得到的數(shù)據(jù)常出現(xiàn)檢測出酸的種類不同，不同酸的檢測靈敏度不同，導(dǎo)致檢測結(jié)果相差大的問題。另外，很多檢測有機(jī)酸的新技術(shù)，檢測結(jié)果一般，但需要配置高端色譜儀和特殊檢測器，由于該類設(shè)備使用范圍過窄，一般實驗室沒有配備，且操作復(fù)雜，需要配備專業(yè)的操作人員，因此相關(guān)技術(shù)很難在一般的實驗室使用。

葡萄酒中的有機(jī)酸種類和含量，是葡萄酒品質(zhì)的晴雨表，對研究發(fā)酵機(jī)理，監(jiān)控發(fā)酵過程具有十分重要的意義。在線檢測或高頻檢測應(yīng)該具備簡便、高靈敏度、高重現(xiàn)性、能檢測出主要有機(jī)酸的特點。根據(jù)已有研究結(jié)果，作者認(rèn)為完善RP－HPLC技術(shù)是研究方向，理由之一是現(xiàn)階段各層次實驗室基本都配置了液相色譜儀，其二該類方法能夠一次性檢測到5～8種主要的有機(jī)酸，在現(xiàn)有RP－HPLC技術(shù)基礎(chǔ)上，研究提高檢測靈敏度，擴(kuò)大檢測的線性范圍的方法并制定新的檢測標(biāo)準(zhǔn)，將為發(fā)展葡萄酒產(chǎn)業(yè)提供很好的技術(shù)支持。

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