田奇琳等

摘 要 植物Ran蛋白與核質(zhì)運(yùn)輸、微管形成等過程密切相關(guān)。通過Tail-RCR結(jié)合接頭連接介導(dǎo)PCR法克隆了龍眼胚性愈傷組織（Embryogenic callus，EC）Ran家族DlRan3A和DlRan3B基因的5′調(diào)控序列，長度分別為1 276和714 bp。結(jié)合生物信息學(xué)法，分析啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和順式作用元件。結(jié)果表明：龍眼EC DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子分別存在1處和3處轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，且除了含有TATA box和CAAT box等基本順式作用元件外，還含有多個(gè)光響應(yīng)元件、激素應(yīng)答元件、防御與逆境脅迫響應(yīng)元件等。龍眼EC DlRan3A和DlRan3B啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性可能受到光、激素信號(hào)及逆境脅迫因素的誘導(dǎo)，在龍眼體胚發(fā)生過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。此外，在DlRan3A啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測到1個(gè)長度為214 bp的CpG島，為后續(xù)研究該基因啟動(dòng)子甲基化水平及分子調(diào)控機(jī)制提供了線索。龍眼EC Ran基因啟動(dòng)子的克隆與生物信息學(xué)分析有助于揭示Ran在體胚發(fā)生過程中的作用。

關(guān)鍵詞 龍眼；體胚發(fā)生；Ran基因；啟動(dòng)子；生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào) S667.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Cloning and Bioinformatic Analysis of the Promoters of DlRan3A and DlRan3B from Embryogenic Callus in Dimocarpus longan

TIAN Qilin， LIN Yuling， LAI Zhongxiong*， WANG Tianchi

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract Ran proteins in plants are closely involved in nucleocytoplasmic transportion and the formation of microtubules. The 5′nontranscribed regions of DlRan3A and DlRan3B from embryogenic callus in Dimocarpus longan were cloned by using Tail-RCR and ligation-mediated PCR. DlRan3A and DlRan3B are the Ran gene family members， and the cloned 5′nontranscribed regions were of 1 276 bp and 714 bp length. Transcription start sites（TSSs） and cis-acting elements were analysed by using bioinformatical methods. The result indicated that the promoters of DlRan3A and DlRan3B had one and three TSSs respectively， including not only the ordinary cis-acting elements of TATA and CAAT box， but also such many cis-acting elements responsive to light， phytohormones and environmental stresses. The transcriptional activity of the promoters of DlRan3A and DlRan3B from embryogenic callus in Dimocarpus longan could be induced by the signals of light， phytohormones and environmental stresses， and it played an key role in the signal transduction in somatic embryogenesis. In addition， a 214 bp length of CpG island was predicted in the promoter of DlRan3A， which provided clues for further research on its methylation level and regulatory mechanisms. Cloning and bioinformatic analysis of the promoters of DlRan3A and DlRan3B from embryogenic callus in Dimocarpus longan would help to reveal the functions of Ran during somatic embryogenesis.

Key words Dimocarpus longan；Somatic embryogenesis；Ran；Promoter；Bioinformatic analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.014

小G蛋白是真核生物中廣泛存在的一類單體蛋白，其分子量約20～40 ku，屬于超家族蛋白。小G蛋白在真核生物進(jìn)化過程中相當(dāng)保守，主要作為分子開關(guān)，在有活性的GTP和GTP水解成的GDP之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，進(jìn)而在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[1]。根據(jù)小G蛋白的結(jié)構(gòu)和功能至少可將其分為5個(gè)亞家族：Ras、Rho、Rab、Arf和Ran。Ran（Ras-related nuclear protein）是Ras超基因家族的多功能小G蛋白，在核質(zhì)運(yùn)輸、微管形成、有絲分裂紡錘體、細(xì)胞周期調(diào)控和核膜形成等方面都具有重要作用[2]。目前對(duì)于植物Ran功能的研究較少。擬南芥中包括4個(gè)RAN成員：AtRAN1、AtRAN2、AtRAN3和AtRAN4，其中AtRAN3在分生組織和發(fā)育的胚胎中表達(dá)水平較高，AtRAN4與鹽脅迫誘導(dǎo)有關(guān)，與其它AtRAN只有65%的相似性[3]。近年來，關(guān)于植物中Ran基因的克隆和功能研究陸續(xù)增多[4-5]，然而關(guān)于該基因啟動(dòng)子的克隆甚至表達(dá)調(diào)控方面的研究較少。方智振等[5]的研究結(jié)果表明，龍眼體胚Ran3的31個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量呈現(xiàn)一定的規(guī)律，在胚性愈傷組織和心形胚表達(dá)量高，而在球形胚表達(dá)量低，表現(xiàn)出與體胚發(fā)生過程中細(xì)胞分裂速率變化模式相似的特點(diǎn)，11個(gè)龍眼體胚Ran 3′UTR在體胚發(fā)生過程中的差異表達(dá)也呈現(xiàn)出基本一致的總體變化趨勢。由此可見，龍眼Ran3不同成員可能與龍眼體胚發(fā)生過程的細(xì)胞增殖有密切的聯(lián)系。本研究以方智振[5]克隆得到的帶有完整ORF的2條龍眼Ran基因DNA序列（DlRan3A和DlRan3B）為基礎(chǔ)，以對(duì)Ran基因的調(diào)控作用進(jìn)行初步研究。

植物啟動(dòng)子是一段能與RNA聚合酶及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA序列，起到?jīng)Q定基因轉(zhuǎn)錄起始的作用。植物基因啟動(dòng)子中包含多種重要的順式作用元件，在轉(zhuǎn)錄水平上參與調(diào)控下游相應(yīng)基因的表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)室方智振[5]的研究基礎(chǔ)上，探索龍眼DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子在龍眼體胚發(fā)生過程的調(diào)控作用，包括其上游調(diào)控序列的順勢作用元件、反式作用因子及它們在一些生物、非生物脅迫過程中的應(yīng)答機(jī)制等。本研究擬采用Tail-RCR結(jié)合接頭連接介導(dǎo)PCR法分離DlRan3A和DlRan3B的5′調(diào)控序列，再利用生物信息學(xué)法，預(yù)測了啟動(dòng)子的順式作用元件和CpG島分布，推測其潛在功能，有助于揭示Ran在體胚發(fā)生過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以本實(shí)驗(yàn)室保存的龍眼胚性愈傷組織為材料，用于DNA的提取。龍眼胚性愈傷組織DlRan3A和DlRan3B基因DNA序列參見方智振[5]的論文。

1.1.2 試劑 染色體步移試劑盒（TaKaRa Genome Walking Kit）、pMD18-T載體（TaKaRa）、膠回收試劑盒（BIOMIGA）；限制性內(nèi)切酶：DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ、StuⅠ（TaKaRa）；T4 DNA ligase、10×Ligation Buffer、Restriction enzyme buffer（10×）（Thermo）等；其它各種引物及接頭序列合成委托北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 龍眼胚性愈傷組織DNA的提取 采用經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室改良的CTAB法[6]提取龍眼胚性愈傷組織DNA。

1.2.2 龍眼DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子克隆與測序 為盡可能獲取龍眼DlRan3A和DlRan3B基因的啟動(dòng)子序列，本研究分別采用各有優(yōu)勢的交錯(cuò)式熱不對(duì)稱PCR染色體步移（Tail-PCR）和接頭連接介導(dǎo)染色體步移法，對(duì)DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

Tail-PCR擴(kuò)增：根據(jù)TaKaRa Genome Walking Kit引物設(shè)計(jì)原則，在已知的龍眼DlRan3A和DlRan3B基因（GenBank收錄號(hào)分別為JQ775539和JQ279697）的已知序列區(qū)（最好不少于500 bp）分別設(shè)計(jì)3條反向且退火溫度較高的特異性引物SP1、SP2和SP3，再與試劑盒中提供的4種經(jīng)過獨(dú)特設(shè)計(jì)的退火溫度較低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)，通過3次巢式PCR反應(yīng)獲得已知序列的側(cè)翼序列。用于擴(kuò)增DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列的特異性引物情況詳見表1。以提取的龍眼胚性愈傷組織DNA為模板，按照TaKaRa Genome Walking Kit說明和林玉玲等[7]的方法進(jìn)行DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子的克隆。

接頭連接介導(dǎo)PCR擴(kuò)增：在利用Tail-RCR法進(jìn)一步擴(kuò)增DlRan3A基因啟動(dòng)子序列屢試未果的前提下，改用接頭連接介導(dǎo)PCR法（利用接頭的PCR法不需要DNA環(huán)化，通常適用于尋找已知DNA序列周圍未知啟動(dòng)子或其它調(diào)控區(qū)域），以期進(jìn)一步得到該基因的5′調(diào)控序列。根據(jù)已采用Tail-RCR擴(kuò)增得到的DlRan3A基因5′側(cè)翼序列（373 bp），在靠近5端約200 bp的位置設(shè)計(jì)2條下游反向引物DlRan3A-SP2和DlRan3A-SP3，接頭序列設(shè)計(jì)按照Universal Genome Walker kit（Clontech）說明書，并根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)上游引物AP1和AP2進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。以提取的龍眼胚性愈傷組織DNA為模板，參考Universal Genome Walker kit（Clontech）說明書和李先昆等[8]的方法進(jìn)行DlRan3A基因啟動(dòng)子的進(jìn)一步克隆。上游引物和接頭序列如下：

接頭序列1：GTAATACGACTCACTATAGGGCA

CGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT

接頭序列2：PO4-ACCAGCCC-NH2

AP1：GTAATACGACTCACTATAGGGC

AP2：ACTATAGGGCACGCGTGGT。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶克隆至pMD18-T載體，插入目的片段測序委托上海博尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN6軟件進(jìn)行測序結(jié)果和已知DNA序列的拼接，并進(jìn)行多重比對(duì)分析。通過在線軟件BDGP（http：//www.fruitfly.

org/seq_tools/promoter.html）預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及可能的核心啟動(dòng)子區(qū)域。利用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.Ugent.be/webtools/ plantcare

/html/）對(duì)DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列中潛在的順式作用元件的種類和分布情況進(jìn)行分析。此外，還利用在線軟件CpG Island Searcher（http：// www.cpgislands.com/）對(duì)啟動(dòng)子序列的CpG島進(jìn)行初步預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍眼DlRan3A和DlRan3B基因5′調(diào)控序列的獲得

采用Tail-RCR法獲得了DlRan3A和DlRan3B基因5′調(diào)控序列的2條帶。測序結(jié)果表明，這2條目的條帶的大小分別為373和811 bp。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2條序列的3′端分別與其已知序列重疊176和290 bp，證實(shí)所克隆獲得的片段為DlRan3A和DlRan3B基因翻譯起始密碼子ATG上游序列。將獲得的序列分別與該基因已知5′端調(diào)控序列進(jìn)行拼接，分別得到261 bp的DlRan3A基因5′端調(diào)控序列和714 bp的DlRan3B基因5′端調(diào)控序列。

根據(jù)已獲得的373 bp DlRan3A基因5′端序列，對(duì)DlRan3A基因的5′端調(diào)控序列進(jìn)行進(jìn)一步Tail-PCR擴(kuò)增，但屢試未果，可能是DlRan3A在基因組中存在較復(fù)雜的序列或是Tail-RCR法的PCR反應(yīng)體系需要進(jìn)一步優(yōu)化，從而導(dǎo)致無法繼續(xù)獲得它的5′端調(diào)控序列。因此，本研究擬改用接頭連接介導(dǎo)PCR法對(duì)DlRan3A基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行進(jìn)一步克隆，結(jié)果在限制性內(nèi)切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ酶切的DNA文庫經(jīng)過第2輪PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得了長度分別約為500、1 200和500 bp的特異性擴(kuò)增片段，測序獲得片段實(shí)際長度分別為491、1 182和491 bp，三者之間長度雖然存在差別，但具有相同的核苷酸序列，說明接頭連接介導(dǎo)法擴(kuò)增效率較高，本研究選擇長度為1 182 bp的序列為DlRan3A基因的5′調(diào)控序列。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DlRan3A基因的3′端與經(jīng)Tail-RCR法初步獲得5′端調(diào)控序列重疊167 bp，經(jīng)過驗(yàn)證證實(shí)本研究又成功向DlRan3A基因啟動(dòng)子上游序列步移了1 015 bp，將2種方法獲得的序列結(jié)合DlRan3A基因已知的5′端調(diào)控序列進(jìn)行拼接，最終獲得1 276 bp的DlRan3A基因5′端調(diào)控序列。

2.2 龍眼Ran家族啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測

經(jīng)過啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在線預(yù)測，DlRan3A基因1 276 bp的5′端調(diào)控序列可能存在3處核心啟動(dòng)子區(qū)域，位于-675～-626、-253～-204和-88～-39 bp，分值分別為0.94、0.99和0.94，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別為A、A和C。此結(jié)果可推測位于-253～-204 bp的序列很可能就是該基因真正的核心啟動(dòng)子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為位于第-213 bp的A（圖1）。

采用在線預(yù)測軟件BDGP對(duì)DlRan3B基因進(jìn)行分析預(yù)測，DlRan3A基因714 bp的5′端調(diào)控序列可能存在1處核心啟動(dòng)子區(qū)域，分別位于-79～-30 bp范圍內(nèi)，分值為0.97，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為C。此結(jié)果可推測位于-79～-30 bp的序列很可能就是該基因真正的核心啟動(dòng)子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為位于-39 bp的C（圖2）。

2.3 龍眼DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子順式元件的功能預(yù)測

啟動(dòng)子生物學(xué)功能的在線預(yù)測結(jié)果表明，DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子區(qū)域中，除了含有大量的核心啟動(dòng)子元件如TATA-box和CAAT-box之外，還存在多種順式元件如與光響應(yīng)、激素應(yīng)答、厭氧反應(yīng)、高轉(zhuǎn)錄水平等有關(guān)的調(diào)控元件及一些未知功能的元件（圖1、2）。DlRan3A基因啟動(dòng)子中具有80個(gè)TATA box、23個(gè)CAAT box、多個(gè)激素應(yīng)答元件和光響應(yīng)元件等（圖1）。DlRan3B基因啟動(dòng)子中具有26個(gè)TATA box、17個(gè)CAAT box、多個(gè)激素應(yīng)答元件、防御與逆境脅迫響應(yīng)元件和光響應(yīng)元件等（圖2）。DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列具有共同的順式元件，也有存在各自特異的順式元件。此外，本研究還從TAIR數(shù)據(jù)庫中下載AtRan3的序列（TAIR收錄號(hào)為AT5G55190），并將其5′端調(diào)控序列（2 082 bp）的PlantCARE預(yù)測結(jié)果與DlRan3A和DlRan3B已獲得的5′端調(diào)控序列預(yù)測結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2.3.1 龍眼DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子中含有多個(gè)光反應(yīng)元件 DlRan3A和DlRan3B總共含有9個(gè)不同類型的光反應(yīng)元件，不同成員之間所含的元件種類和數(shù)量有所不同，DlRan3A基因5′端調(diào)控序列所含的光反應(yīng)元件較多（7個(gè)：Box 4、Box I、GAG-motif、GT1-motif、TCCC-motif、AE-box和TCT-motif），而DlRan3B僅5個(gè)（Box I、 GAG-motif、 I-box、 Sp1和TCCC-motif）。 AtRan3啟動(dòng)子區(qū)含有9種光反應(yīng)元件（Box 4、 Box I、 G-box、 GA-motif、 GAG-motif、 GT1-motif、 GTGGC-motif、 I-box、 chs-Unit 1 m1）。

DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列中，Box I、GAG-motif和TCCC-motif是2條序列共有的，說明這幾個(gè)元件在龍眼Ran家族部分成員中具有保守性，有利于維持其功能。I-box、Sp1是DlRan3B基因啟動(dòng)子區(qū)特有的，而AE-box、Box 4、GT1-motif和TCT-motif是DlRan3A基因啟動(dòng)子區(qū)特有的，說明龍眼Ran家族部分不同成員在特定條件下具有不同的功能。DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列與AtRan3共有的光反應(yīng)順式元件有Box 4、Box I、GAG-motif、GT1-motif和I-box，這幾個(gè)元件在進(jìn)化上高度保守，而AtRan3含有的元件G-box、GA-motif、GTCCC-motif和chs-Unit 1 m1等是龍眼Ran家族啟動(dòng)子序列中未預(yù)測到的，可能是不同物種在不同階段的基因功能特異性導(dǎo)致的。

2.3.2 龍眼DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子中含有多個(gè)激素應(yīng)答元件 DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列除了含有多個(gè)光反應(yīng)元件之外，還含有5個(gè)參與生長素、赤霉素、水楊酸和茉莉酸甲酯等激素應(yīng)答的順式元件，說明它們在相應(yīng)的激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中可能具有重要的作用。其中不同成員之間所含的元件種類和數(shù)量有所不同，DlRan3A基因5′端調(diào)控序列含有參與茉莉酸甲酯、生長素和水楊酸激素應(yīng)答的4種元件， DlRan3B含有參與茉莉酸甲酯、赤霉素和水楊酸激素應(yīng)答的4種元件，而AtRan3則含有參與茉莉酸甲酯、赤霉素和乙烯應(yīng)答的4種元件。導(dǎo)致不同成員所含的順式元件種類和數(shù)量的不同以及和擬南芥同源基因的差異，其原因可能是克隆得到的調(diào)控序列長度不同，不同成員基因具有功能特異性及不同物種進(jìn)化的特異性等。

DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列中，TCA-element、CGTCA-motif和TGACG-motif是2條序列共有的，分別參與水楊酸和茉莉酸甲酯激素應(yīng)答反應(yīng)，說明DlRan3A和DlRan3B基因在水楊酸和茉莉酸甲酯激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中均發(fā)揮作用。而TGA-box生長素應(yīng)答元件是DlRan3A基因啟動(dòng)子區(qū)特有的，GARE-motif赤霉素應(yīng)答元件是DlRan3B基因啟動(dòng)子區(qū)特有的，說明DlRan3A和DlRan3B基因又各自參與不同激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。DlRan3A和DlRan3B基因5端調(diào)控序列與AtRan3共有的激素應(yīng)答順式元件是分別參與赤霉素和茉莉酸甲酯應(yīng)答的順式元件GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif， 然而AtRan3所含的ERE乙烯應(yīng)答元件在DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列中沒有預(yù)測到，可能在龍眼體胚發(fā)生過程中，這2個(gè)成員并不參與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

2.3.3 龍眼DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子中含有多個(gè)逆境響應(yīng)元件 在DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列中也預(yù)測到多個(gè)參與逆境響應(yīng)的順式元件，包括厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、防御與逆境響應(yīng)元件和病原體誘導(dǎo)響應(yīng)元件等。DlRan3A和DlRan3B共含有4個(gè)不同類型的逆境響應(yīng)元件，AtRan3的5′端調(diào)控序列含有6種逆境響應(yīng)元件，三者均含有ARE厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件和TC-rich repeats防御與逆境響應(yīng)元件，說明這2個(gè)元件在龍眼Ran家族這2個(gè)成員間甚至物種之間保守性高。此外DlRan3A的5′端調(diào)控序列還含有參與傷害和病原體誘導(dǎo)響應(yīng)的box S元件，DlRan3B還含有LTR低溫響應(yīng)元件，AtRan3啟動(dòng)子區(qū)含有Box-W1、ELI-box3、HSE和AT-rich sequence，分別參與真菌誘導(dǎo)、誘導(dǎo)子、熱擊脅迫和極大誘導(dǎo)子介導(dǎo)激活等過程；這些在DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列中未預(yù)測到，可能與獲得的序列長度有限有關(guān)。

2.3.4 龍眼DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子中含有胚乳表達(dá)響應(yīng)元件 在DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列中還預(yù)測到可能參與胚乳表達(dá)的相關(guān)元件。DlRan3A基因含有AACA_motif，此元件負(fù)調(diào)控胚乳表達(dá)，DlRan3B基因含有Skn-1_motif胚乳表達(dá)正調(diào)控元件，可見DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子在調(diào)控胚乳表達(dá)過程中可能存在復(fù)雜的相互作用機(jī)制，而Skn-1_motif也存在于AtRan3基因啟動(dòng)子區(qū)，說明Skn-1_motif元件在不同植物Ran基因在胚乳中的表達(dá)可能均起著重要調(diào)控作用。

2.3.5 龍眼DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子中序列中含有大量功能未知或特異性相關(guān)的順式元件 除了含有以上順式元件以外，DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列中還含有一系列未命名的、功能未知的順式元件。Unnamed_1、Unnamed_3和Unnamed_4是DlRan3B和DlRan3A及AtRan3基因啟動(dòng)子中共同存在的，說明這3個(gè)元件在Ran基因表達(dá)調(diào)控中可能具有重要作用。此外，DlRan3A中還存在Unnamed_8、Unnamed_12和Unnamed_2等功能未知元件。

DlRan3A和DlRan3B基因及AtRan3基因啟動(dòng)子區(qū)還含有提高轉(zhuǎn)錄效率的5UTR Py-rich stretch序列。DlRan3A還含有可能參與玉米醇溶蛋白代謝相關(guān)的順式作用元件O2-site、有關(guān)分生組織特異激活表達(dá)的CCGTCC-box元件、A-box和ATGCAAAT motif元件，DlRan3B含有α淀粉酶啟動(dòng)子的保守序列。AtRan3基因啟動(dòng)子區(qū)含有可能參與細(xì)胞周期響應(yīng)的circadian元件，而龍眼Ran家族成員中沒有預(yù)測到相關(guān)元件。

2.4 龍眼DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子CpG島的預(yù)測

本研究利用在線軟件CpG Island Searcher[9]對(duì)DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行CpG島的預(yù)測，根據(jù)Gardiner-Garden等[10]對(duì)CpG島的定義，設(shè)定預(yù)測條件為：CpG島長度至少200 bp的區(qū)域，間隔至少100 bp，其中GC所占比例超過50%，且CpG的實(shí)際值/期望值比例高于0.6。結(jié)果在DlRan3B基因啟動(dòng)子區(qū)沒有預(yù)測到符合限定條件的CpG島，可能與獲得序列長度不同有關(guān)，在DlRan3A基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測到1個(gè)CpG島分布區(qū)，位于第995～1 168 bp范圍內(nèi)，GC含量為50%，CpG的實(shí)際值/期望值比例為1.143，CpG島長度為214 bp（圖2、3）。

3 討論與結(jié)論

3.1 龍眼Ran家族啟動(dòng)子克隆方法的選擇

植物基因啟動(dòng)子的克隆及功能研究對(duì)于了解植物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。近年來，啟動(dòng)子克隆的方法主要是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來，包括常規(guī)PCR、環(huán)狀PCR（I-PCR、P-PCR）、錨定PCR、接頭連接介導(dǎo)的PCR和熱不對(duì)稱交錯(cuò)式PCR技術(shù)（Tail-PCR）等[11]。Tail-PCR法具有簡單、快速、高特異性和高效等優(yōu)點(diǎn)，避免了酶切和連接，成為廣泛應(yīng)用的的擴(kuò)增基因側(cè)翼序列的方法。本研究中利用Tail-PCR法可以一次性獲得5′端側(cè)翼序列，但未能進(jìn)一步擴(kuò)增特異條帶，可能是由于要擴(kuò)增的5′端側(cè)翼序列結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，含有特殊的堿基序列，或者引物的退火溫度和PCR模板稀釋倍數(shù)等因素仍需要進(jìn)一步優(yōu)化，而Tail-PCR法的隨機(jī)簡并引物的結(jié)合位點(diǎn)有限，所以即使利用不同的簡并引物也難以擴(kuò)增到特異性結(jié)果。其他方法如反向PCR（IPCR）法雖然在低拷貝側(cè)翼序列的擴(kuò)增中有較好的特異性和靈敏度，但DNA環(huán)化過程中常產(chǎn)生多聯(lián)體，或者DNA自連，從而導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增較多。為了提高擴(kuò)增特異性，本研究擬采用接頭連接介導(dǎo)PCR法進(jìn)一步擴(kuò)增DlRan3A的5′端側(cè)翼序列，得到較理想的結(jié)果。接頭連接介導(dǎo)PCR法是通過在未知序列上連接特異性接頭，利用與這對(duì)接頭序列互補(bǔ)的引物專一性地?cái)U(kuò)增目的DNA片段的方法。在酶切文庫的構(gòu)建和加接頭等步驟準(zhǔn)確無誤的前提下，此方法能夠準(zhǔn)確地錨定模板，提高擴(kuò)增特異性。

3.2 龍眼DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子的潛在功能

光或激素可以刺激植物細(xì)胞促進(jìn)其轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子甚至是光感受器和激素受體等，促進(jìn)核質(zhì)運(yùn)輸，這些過程還受到Ran蛋白的調(diào)控[12]。DlRan3A基因啟動(dòng)子區(qū)含有生長素響應(yīng)元件，說明植物Ran可能在生長素調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中甚至核質(zhì)運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用。Ran結(jié)合蛋白和Ran-GDP/Ran-GTP梯度對(duì)生長素誘導(dǎo)的有絲分裂進(jìn)程也具有重要影響[13]。在DlRan3B基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測到赤霉素響應(yīng)元件，而赤霉素不僅影響體胚發(fā)生到種子萌發(fā)的轉(zhuǎn)變[14]；還正調(diào)控體胚發(fā)生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)[15]。已有研究表明，赤霉素在促進(jìn)體胚發(fā)生過程中還伴隨著提高α淀粉酶的活性促進(jìn)淀粉水解的過程[16]；而在DlRan3B基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測到的α淀粉酶啟動(dòng)子保守序列可以說明DlRan3B可能參與調(diào)節(jié)α淀粉酶活性結(jié)合赤霉素信號(hào)調(diào)節(jié)從而影響龍眼體胚發(fā)生過程。此外，DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子均含有的參與茉莉酸甲酯響應(yīng)和水楊酸響應(yīng)的順式元件，可能影響植物抗病和體胚發(fā)生過程。

植物Ran蛋白如何應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化及其反應(yīng)機(jī)制的研究具有重要意義。水稻OsRAN2過表達(dá)不僅可提高水稻的抗寒性，還可提高耐鹽和滲透脅迫的能力[17-18]。DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子區(qū)均含有厭氧誘導(dǎo)和防御與脅迫響應(yīng)元件；DlRan3A基因啟動(dòng)子還含有參與傷害和病原體誘導(dǎo)的響應(yīng)元件， DlRan3B含有低溫響應(yīng)元件。龍眼Ran家族很可能響應(yīng)厭氧、低溫、傷害和病原體等的誘導(dǎo)，通過不同成員及與環(huán)境因素的相互作用，提高自身活性，從而增強(qiáng)抵抗逆境脅迫的能力。

DlRan3A和DlRan3B基因啟動(dòng)子序列中分別存在可能參與胚乳特異表達(dá)響應(yīng)的元件AACA_motif和Skn-1_motif，Skn-1_motif是胚乳中特異表達(dá)所必需的正調(diào)控元件，而AACA_motif負(fù)調(diào)控胚乳特異表達(dá)，DlRan3A基因啟動(dòng)子區(qū)還含有參與分生組織特異表達(dá)應(yīng)答的順式元件CCGTCC-box，可以預(yù)見轉(zhuǎn)錄因子可能通過結(jié)合龍眼Ran家族不同成員啟動(dòng)子的順式元件，調(diào)控它們在胚乳或者分生組織中的轉(zhuǎn)錄水平，通過影響特異組織的發(fā)育，調(diào)控龍眼體胚發(fā)生的過程。

龍眼Ran家族在機(jī)理上如何參與影響植物激素水平，不同成員如何同植物激素相互作用等問題還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來支持推測；且龍眼Ran家族不同成員可能在特定逆境條件下各自發(fā)揮重要的作用，在某些逆境條件下可能共同發(fā)揮調(diào)控作用。綜上所述，究竟Ran在龍眼體胚發(fā)生過程中如何調(diào)節(jié)植物細(xì)胞以應(yīng)對(duì)脅迫，如何應(yīng)答逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等一系列問題還需進(jìn)一步研究。

3.3 龍眼DlRan3A基因啟動(dòng)子序列“CpG島”的潛在功能

CpG島中5-甲基胞嘧啶的DNA甲基化是表觀遺傳最主要的方式之一，具有重要的生物學(xué)功能。在哺乳動(dòng)物基因組中，除了少數(shù)胚胎干細(xì)胞之外，DNA甲基化大多發(fā)生在CpG二核苷酸富集序列，而近年來的研究結(jié)果證明，高等植物基因組中同樣存在豐富的CpG二核苷酸甲基化修飾位點(diǎn)[19]。CpG結(jié)合蛋白（MBD）是一類能與甲基化CpG島特異結(jié)合并相互作用的蛋白質(zhì)，它們具有共同的由60～80個(gè)氨基酸組成的甲基化CpG結(jié)合域，能夠在甲基化的啟動(dòng)子區(qū)募集組蛋白去乙?；浮⒔M蛋白乙?；?、組蛋白甲基化酶和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，使得該區(qū)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致基因沉默。已有研究表明，擬南芥AtMBD5在AtRan3作用下定位于染色體周圍，在植物細(xì)胞分裂過程中，通過結(jié)合和脫離5-甲基胞嘧啶，調(diào)控維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)[20]。研究結(jié)果顯示Ran蛋白在植物細(xì)胞的染色體運(yùn)動(dòng)中可能具有關(guān)鍵作用。

本研究在DlRan3A基因啟動(dòng)子區(qū)預(yù)測到1個(gè)CpG島，在DlRan3B啟動(dòng)子區(qū)則未預(yù)測到，可能與獲得的啟動(dòng)子序列較短有關(guān)，說明高等植物基因組中CpG島不一定富集分布于啟動(dòng)子區(qū)或者分布于5′端側(cè)翼序列的位置存在差異[21]。通過檢測這段序列在龍眼體胚發(fā)生不同階段的甲基化水平，有助于深入研究在不同階段DlRan3A基因所起的調(diào)控作用，尤其在染色體運(yùn)動(dòng)方面。染色體運(yùn)動(dòng)依賴于紡錘體微管的組裝和去組裝，而Ran參與控制微管的形成[22]，說明DlRan3A可能參與調(diào)控龍眼體胚發(fā)生的細(xì)胞分裂過程，研究DlRan3A基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平可為后續(xù)工作提供重要線索。

參考文獻(xiàn)

[1] Inaba T， Nagano Y， Sakakibara T， et al. Identification of a cis-regulatory element involved in phytochrome down-regulated expression of the pea small GTPase gene pra2[J]. Plant Physiology， 1999， 120（2）： 491-500.

[2] Jiang S Y， Ramachandran S. Comparative and evolutionary analysis of genes encoding small GTPases and their activating proteins in eukaryotic genomes[J]. Physiological Genomics，2006， 24（3）： 235-251.

[3] Vernoud V， Horton A C， Yang Z， et al. Analysis of the small GTPase gene superfamily of Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2003， 131（3）： 1 191-1 208.

[4] Lü S， Fan Y， Jin C. Overexpression of a Ran GTPase homologous gene， FaRan from tall fescue， in transgenic Arabidopsis[J]. Biologia Plantarum， 2011， 55（2）： 331-334.

[5] 方智振. 龍眼體胚發(fā)生中期的蛋白質(zhì)組學(xué)及Ran家族表達(dá)調(diào)控研究[D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2012.

[6] 陳桂信， 呂柳新， 賴鐘雄， 等. 柰基因組DNA的提取與純化[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2004， 26（3）： 329-333.

[7] Lin Y L， Lai Z X. Superoxide dismutase multigene family in longan somatic embryos： a comparison of CuZn-SOD， Fe-SOD， and Mn-SOD gene structure， splicing， phylogeny， and expression[J]. Molecular Breeding， 2013， 32（3）： 595-615.

[8] 李先昆，段翠芳，聶智毅，等. 巴西橡膠樹小橡膠粒子蛋白（SRPP）基因啟動(dòng)子的克隆及其功能分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009， 25（1）： 241-247.

[9] Takai D， Jones P A. The CpG island searcher： a new WWW resource[J]. In Silico Biology， 2003， 3（3）： 235-240.

[10] Gardiner-Garden M， Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes[J]. Journal of Molecular Biology， 1987， 196（2）： 261-282.

[11] 聶麗娜， 夏蘭琴， 徐兆師，等. 植物基因啟動(dòng)子的克隆及其功能研究進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2008， 9（3）： 385-391.

[12] Lee Y， Lee H S， Lee J S， et al. Hormone-and light-regulated nucleocytoplasmic transport in plants： current status[J]. Journal of Experimental Botany， 2008， 59（12）： 3 229-3 245.

[13] Kim S-H， Roux S J. An Arabidopsis Ran-binding protein，AtRanBP1c， is a co-activator of Ran GTPase-activating protein and requires the C-terminus for its cytoplasmic localization[J]. Planta， 2003， 216（6）： 1 047-1 052.

[14] Gómez-Cadenas A， Zentella R， Walker-Simmons M K， et al. Gibberellin/abscisic acid antagonism in barley aleurone cells：site of action of the protein kinase PKABA1 in relation to gibberellin signaling molecules[J]. The Plant Cell Online， 2001， 13（3）： 667-679.

[15] Chen M， Du X， Zhu Y， et al. Seed Fatty Acid Reducer acts downstream of gibberellin signalling pathway to lower seed fatty acid storage in Arabidopsis[J]. Plant， Cell & Environment，2012， 35（12）： 2 155-2 169.

[16] Knpczyńska E， Zielińska S. Regulation of Medicago sativa L. somatic embryos regeneration by gibberellin A3 and abscisic acid in relation to starch content and α-amylase activity[J]. Plant Growth Regulation， 2006， 49（2-3）： 209-217.

[17] Zang A， Xu X， Neill S， et al. Overexpression of OsRAN2 in rice and Arabidopsis renders transgenic plants hypersensitive to salinity and osmotic stress[J]. Journal of Experimental Botany，2010， 61（3）： 777-789.

[18] Chen N， Xu Y， Wang X， et al. OsRAN2， essential for mitosis， enhances cold tolerance in rice by promoting export of intranuclear tubulin and maintaining cell division under cold stress[J]. Plant， Cell & Environment， 2011， 34（1）： 52-64.

[19] Saze H， Tsugane K， Kanno T， et al. DNA methylation in plants：relationship to small RNAs and histone modifications，and functions in transposon inactivation[J]. Plant and Cell Physiology， 2012， 53（5）： 766-784.

[20] Yano A， Kodama Y， Koike A， et al. Interaction between methyl CpG-binding protein and ran GTPase during cell division in tobacco cultured cells[J]. Annals of Botany， 2006， 98（6）： 1 179-1 187.

[21] Shimizu T S， Takahashi K， Tomita M. CpG distribution patterns in methylated and non-methylated species[J]. Gene，1997， 205（1）： 103-107.

[22] Wilde A， Zheng Y. Stimulation of microtubule aster formation and spindle assembly by the small GTPase Ran[J]. Science，1999， 284（5 418）： 1 359-1 362.

責(zé)任編輯：黃東杰