趙海珍 曹坤
【摘要】目的 建立紅曲保健食品中洛伐他汀的含量測定方法。方法 采用Hypersil C18(4.6×250mm,5μm),以甲醇-水-磷酸(75:25:0.2)為流動相,流速1.0mL/min,檢測波長238nm,進樣10μL。結(jié)果 線性:洛伐他汀在0.205~1.845μg濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系;回收率:平均回收率為99.89%,RSD為1.05%。結(jié)論 本法簡便、快速、準確,可作為紅曲保健食品中洛伐他汀的質(zhì)控方法。
【關(guān)鍵詞】HPLC;恩替卡韋分散片;含量測定
紅曲是以秈米為原料,采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)分離出優(yōu)質(zhì)的紅曲霉菌(monascuspurpureus)經(jīng)液體深層發(fā)酵精制而成的一種純天然、安全性高、有益于人體健康的食品添加劑。紅曲內(nèi)含有多種他汀類成分(最主在的存在形式為酸式和內(nèi)酯式),輔助降血脂功效顯著,因此而被廣泛的應(yīng)用于保健食品領(lǐng)域,目前,國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)大多采用《保健食品功效成分及衛(wèi)生檢驗規(guī)范》中的方法測定洛伐他汀含量,原理是將不同存在形式的洛伐他汀經(jīng)預(yù)處理轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯式,采用內(nèi)酯式對照品定量,從而控制保健食品質(zhì)量。然而,經(jīng)我中心研究表明:該方法萃取程序受樣品狀態(tài)影響嚴重,并不能完全保證紅曲中的洛伐他汀成分完全被檢出而經(jīng)常會造成檢驗結(jié)果偏低,影響實驗人員正確的結(jié)果判定,本文采用堿化預(yù)處理方法,將不同存在形式的洛伐他汀轉(zhuǎn)化為酸式結(jié)構(gòu),再經(jīng)HPLC法測定含量,樣品處理方法簡便,結(jié)果準確可靠。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
1.1.1 儀器 Waters515型高效液相色譜儀,Waters2487紫外檢測器。
1.1.2 試劑 甲醇為色譜純,水為超純水,磷酸為色譜純,氫氧化鈉為分析純,洛伐他汀對照品(購自中國藥品生物制品檢定所),紅曲保健食品制劑均為本廠自制。
2 試驗方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
Hypersil C18(4.6×250mm,5μm),以甲醇-水-磷酸(75:25:0.2)為流動相,流速1.0mL/min,檢測波長238nm,進樣10μL。理論塔板數(shù)按洛伐他汀峰計算應(yīng)不低于3000,洛伐他汀峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。
2.2 溶液的配制
2.2.1 標準儲備液的制備 準確稱取洛伐他汀標準品50mg,加入流動相并定容至100mL。此溶液每mL含0.5mg洛伐他汀。
2.2.2 標準使用液的制備 精密量取上述標準儲備液1mL用0.2mol/L氫氧化鈉溶液定容至5mL,50℃條件下超聲1.5小時,放置至室溫后靜置1小時。此溶液每mL含100μg洛伐他汀。
2.2.2 供試品溶液制備 取樣品20片,精密稱定,研細,精密稱取適量(約相當于洛伐他汀50mg)于100 mL量瓶中,加入60mL75%乙醇搖勻,室溫下超聲50min,加入75%乙醇定容至刻度,冷卻至室溫后以3000r/min的旋轉(zhuǎn)速度離心10min,取上清液,用0.45μm微孔濾膜過濾,精密吸取續(xù)濾液1mL置5mL量瓶中,用0.2mol/L氫氧化鈉溶液定容,50℃條件下超聲1.5小時,放置至室溫后靜置1小時。
2.3 方法學考察
2.3.1 專屬性試驗
按處方配制不含紅曲的空白片,依法測定,結(jié)果在洛伐他汀出峰處無吸收,故空白輔料不干擾含量測定。
2.3.2 線性關(guān)系
精密稱取洛伐他汀對照品0.1025g,依法配制標準儲備液、標準使用液,濃度為205μg/mL。精密量取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL,分別置10mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻;精密量取10μL分別注入高效液相色譜儀,以峰面積為縱坐標,對照品濃度為模坐標進行線性回歸,繪制標準曲線,結(jié)果表明,在0.205~1.845μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,得回歸方程:A=4.902×105C+5.882×104 r=0.9999。
2.3.3 精密度試驗
取線性關(guān)系試驗項下(濃度為102.5μg/mL)的對照品溶液,精密量取10μL注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,連續(xù)進樣6次RSD%為0.29%,方法精密度良好。
2.3.4 穩(wěn)定性試驗
取含量測定線性關(guān)系試驗項下(濃度為102.5μg/mL)的供試品溶液,分別于0、1、2、3小時精密量取10μL注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,結(jié)果RSD值小于2%,表明含量測定溶液在3小時內(nèi)測定穩(wěn)定。
2.3.5 回收率試驗
取相當于20片的主藥量與輔料量,精密稱定,混合均勻,研細,精密稱取細粉適量(約相當于洛伐他汀40mg、50mg、60mg)各三份,分別置100 mL量瓶中,加入60mL75%乙醇搖勻,室溫下超聲50min,加入75%乙醇定容至刻度,冷卻至室溫后以3000r/min的旋轉(zhuǎn)速度離心10min,取上清液,用0.45μm微孔濾膜過濾,精密吸取續(xù)濾液1mL置5mL量瓶中,用0.2mol/L氫氧化鈉溶液定容,50℃條件下超聲1.5小時,放置至室溫后靜置1小時。取線性關(guān)系試驗項下(濃度為102.5μg/mL)的供試品溶液,作為對照品溶液。精密量取上述溶液各10μL分別注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,結(jié)果:平均回收率為99.88%,RSD為1.05%。本方法準確度良好。
3 討論
紅曲中洛伐他汀存在形式多樣,其主要為酸式和內(nèi)酯式結(jié)構(gòu),據(jù)文獻報道:洛伐他汀含量測定方法有3種:第一種是分別測一內(nèi)酯和開環(huán)形式,但有機溶劑提取后除了內(nèi)酯與開環(huán)形式外,尚含有有機溶劑和洛伐他汀的酯化形式,檢測結(jié)果不準確;第二種是酯化處理將酯式形式轉(zhuǎn)化為內(nèi)酯形式,測定其總量,而實際上很難轉(zhuǎn)化完全;第三種是堿化處理將內(nèi)酯式轉(zhuǎn)化為酸式形式,測定其總量,因內(nèi)酯式僅在純甲醇中較為穩(wěn)定,在水-醇溶劑中酸式形式更穩(wěn)定。本文采用第三種方法對紅曲保健食品進行含量測定,回收率接近100,方法科學、準確、可靠。并且,我中心通過對含量測定堿化條件的充分篩選,使樣品預(yù)處理過程簡便快捷。
參考文獻
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