張妮 劉菊華 賈彩紅 張建斌 徐碧玉 金志強

摘 要 以香蕉MuMADS1為誘餌載體，采后2 d的香蕉果實的cDNA文庫為獵物，采用酵母雙雜交的方法得到了泛素激活酶E1的基因片段，命名為MuUBA。采用雙分子熒光互補技術(shù)進一步驗證MuMADS1與MuUBA在植物體內(nèi)的相互作用。熒光實時定量PCR結(jié)果表明，MuMADS1和MuUBA在香蕉中子房發(fā)育第4個階段的表達量最高，但是在莖中的表達量很低，表明其在不同的組織和發(fā)育的果實中的表達具有協(xié)同性。MuMADS1和MuUBA的表達都受外源乙烯和1-MCP的高度調(diào)控，推測MuMADS1和MuUBA在香蕉果實的采后成熟過程中具有很重要的作用。

關(guān)鍵詞 香蕉；酵母雙雜交；MuMADS1；MuUBA；相互作用；采后果實

中圖分類號 Q789 文獻標(biāo)識碼 A

MADS-box基因編碼的蛋白質(zhì)是一類數(shù)量龐大的具有一定保守性的轉(zhuǎn)錄因子，主要在植物中被發(fā)現(xiàn)，但是在少數(shù)動物和真菌中也有報道。MADS的名字起源于4類MADS-box基因，即釀酒酵母的MCM1、擬南芥的AGAMOUS、金魚草的DEFICIENS及人類的SRF4的首字母。MADS-box基因的功能貫穿于植物的整個生長發(fā)育過程，包括根結(jié)構(gòu)的形成[1]，花分生組織的形成和開花[2]，植物光合作用和營養(yǎng)代謝[3]，激素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]，果實的生長發(fā)育和成熟[5-6]。

MADS-box轉(zhuǎn)錄因子通過與DNA或蛋白質(zhì)相互作用來調(diào)控植物的生長和發(fā)育過程[7]。早期在番茄中對MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的研究發(fā)現(xiàn)TM6和TM3存在相互作用[8]。在擬南芥中AGAMOUS（AG）與MADS-box中4個蛋白AGL2（SEP1）、AGL4（SEP2）、AGL6和AGL9（SEP3）存在相互作用[9]。Brambilla等[10]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)SEP和BEL1能夠形成二聚體，調(diào)控著子房的發(fā)育。另外，MADS-box蛋白還可以跟其它非MADS-box蛋白相互作用，如與組氨酸折疊蛋白NF-YB相互作用[11]。Hsu WH等[12]發(fā)現(xiàn)AGL13促進和調(diào)控花粉和胚珠的發(fā)育。Dong T等[13]在番茄中發(fā)現(xiàn)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子SIMADS1對果實的成熟起到了負調(diào)控的作用。盡管在這些方面已經(jīng)有了很多的研究，但是關(guān)于MADS-box的調(diào)控機理卻知之甚少。

雖然酵母雙雜交被應(yīng)用于很多種植物來研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，但是這種技術(shù)在香蕉上的應(yīng)用很少。筆者從香蕉果實的抑制差減文庫中分離了1個D類MADS-box基因，命名為MuMADS1，該基因主要在不同發(fā)育階段的子房中表達，在果實中的表達量很大程度上受外源乙烯的誘導(dǎo)，并且促使乙烯的生物合成和果實的成熟[14]。將其連接到誘餌載體（pGBKT7）上，通過酵母雙雜交實驗，獲得了1個泛素激酶E1的基因片段，并將此基因片段命名為MuUBA。對MuMADS1和MuUBA在香蕉不同組織、果實發(fā)育的不同時期以及不同處理條件下的表達特性也進行了研究。研究結(jié)果將有助于更好地了解MADS-box基因在香蕉果實發(fā)育和成熟過程中的調(diào)控機理。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

香蕉（Musa acuminata L. AAA group，cv. Brazilian）取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所香蕉基地（澄邁，海南）綠熟期（開花后100～110 d）的果實。挑選具有相似生長發(fā)育階段的香蕉，并且從每把香蕉上取5個香蕉指，分成3組進行不同的處理。其中一組讓其自然成熟，第2組用濃度為100 μL/L的乙烯處理12 h，最后一組用濃度為1 μL/L的1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）（乙烯抑制劑）處理12 h[15]。處理后的材料放在25 ℃的環(huán)境中成熟，選取不同成熟期的果實在液氮中速凍后，儲存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2 酵母雙雜交

酵母雙雜交根據(jù)MATCHMAKERTM GAL4雙雜交系統(tǒng)3（Clontech，http：//www.clontech.com/）試劑盒進行。采用PCR技術(shù)獲得含MuMADS1基因的開放閱讀框，引物分別是P1： 5-CGGAATTCGAT

GGGAAGGGGTAAGAT-3，P2： 5-CGGTCGACTCAC

GCCGCTGAATCCGC-3。PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ and SalⅠ進行酶切，然后克隆到具有EcoRI-SalI酶切位點的誘餌載體pGBKT7上，然后進行免疫檢測。同時，根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明，用采后2 d的香蕉果實總RNA來構(gòu)建cDNA文庫（Clontech，http：//www.clontech.com/）。隨后將構(gòu)建的誘餌載體和cDNA文庫共同轉(zhuǎn)入酵母細胞，總共獲得1.5×106個酵母轉(zhuǎn)化株。

1.3 MuUBA的克隆和序列分析

將酵母雙雜交技術(shù)獲得的單克隆于不同營養(yǎng)缺陷型的培養(yǎng)基SD/-Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp+x-a-gal上進行篩選。用長鏈PCR引物擴增得到泛素激酶E1的片段，所用的引物如下，P1： 5-CTAT

TCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3，P2： 5-

GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 1 min，94 ℃ 30 s，68 ℃ 3 min，30個循環(huán)。得到的PCR產(chǎn)物克隆到PMD-18T（購自TaKaRa公司）載體并進行測序，BLAST（http：//ncbi.nlm.nih.gov/blast）進行序列比對，采用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域。

1.4 RNA的提取和cDNA的合成

使用CTAB法[16]從香蕉的根、莖、葉、花、果實和不同發(fā)育階段的子房以及不同處理條件下的果實中提取總RNA。cDNA第一鏈的合成使用了SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit試劑盒（Clontech，Palo Alto，CA，USA），根據(jù)試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄。

1.5 熒光實時定量PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母雙雜交分離得到MuUBA

酵母雙雜交篩選到的泛素激酶E1的片段大小為389 bp，命名為MuUBA（圖1-A）。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，MuUBA在它的C末端具有保守結(jié)構(gòu)域KVVDLVAKVEDVVVACEDE-DVDIPL-SIYFR，屬于UBA家族中的一員（圖1-B）。

2.2 MuMADS1和MuUBA在香蕉不同組織和果實發(fā)育的不同階段中的表達

RT-PCR分析結(jié)果表明，MuMADS1和MuUBA都是在子房發(fā)育的第4階段（Ov4）表達量最高，這個階段是香蕉果實迅速生長發(fā)育時期。在Ov4時期，MuMADS1和MuUBA的相對表達量分別達到了7.59和12.94，在開花時期，它們的表達量分別為1.88和1.60。這兩個基因在莖中只有極少量的表達（圖2）。這些結(jié)果表明基因MuMADS1和MuUBA在不同的組織和果實發(fā)育的不同時期的表達具有協(xié)同性。

2.3 乙烯和1-MCP共同調(diào)控MuMADS1和MuUBA的表達

在自然成熟的香蕉果實中，MuMADS1和MuUBA的表達量是逐漸上升的，分別在采后的第12天和18天達到最高峰，然后下降（圖3-A）。在外源乙烯的處理下，MuMADS1和MuUBA的表達量迅速上升，達到峰值10.69和169.78，與自然成熟的果實相比提前了7 d和16 d（圖3-B）。在1-MCP的處理下，MuMADS1和MuUBA的表達都強烈地受到了抑制，只保持在一個很低的表達水平（圖3-C）。結(jié)果表明，MuMADS1和MuUBA可能共同參與乙烯對果實成熟過程的調(diào)控。

3 討論與結(jié)論

在不同的真核生物中，MADS-box蛋白是作為一類轉(zhuǎn)錄因子存在的，它在植物的生長發(fā)育過程中起到了很重要的作用，這種作用是通過與其它蛋白質(zhì)形成同源或者異源二聚體或者蛋白復(fù)合物而實現(xiàn)的[7]。前期的研究結(jié)果表明，MuMADS1主要在發(fā)育的子房中大量表達，在根中也有少量的表達，并且與乙烯的生物合成途徑和果實的成熟過程密切相關(guān)[12]。同時，香蕉果實的成熟和大量基因的表達都起始于采后第2天[17]，因此，本研究以香蕉MuMADS1為誘餌，采用酵母雙雜交技術(shù)從采后2 d果實的獵物cDNA文庫中分離到了泛素激酶E1的基因片段，命名為MuUBA。MuUBA含有UBA家族中的保守序列，這些結(jié)構(gòu)是與它所具有的激活功能密切相關(guān)的（圖1）。

泛素蛋白在很多生物途徑中起到了至關(guān)重要的作用，如細胞的生長、植物激素應(yīng)答的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、光合作用等[18-20]。泛素化途徑水解目標(biāo)蛋白時，首先在目標(biāo)蛋白之間通過形成一個硫酯鍵，在泛素激活酶E1的活躍位點上存在1個半胱氨酸，這樣可以激活泛素[21]。E1酶催化ATP耦聯(lián)激活反應(yīng)中關(guān)鍵的第一步，通過定位反應(yīng)使得泛素蛋白和特異靶位點結(jié)合，其在識別靶蛋白泛素化過程中起到關(guān)鍵作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)MuMADS1和MuUBA的相互作用，表明由泛素介導(dǎo)的MADS-box蛋白降解過程可能參與MADS結(jié)構(gòu)域蛋白水平的調(diào)節(jié)。

對這兩個蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄水平方面的表達特性進行了進一步的研究（圖2），MuMADS1和MuUBA在子房發(fā)育的第4個階段都有很高的表達量，也就是香蕉果實迅速生長的階段，但是在根和莖中的表達量卻很低。這個結(jié)果與文獻[14]報道過的MuMADS1在子房中表達量高，在根莖中的表達量低的結(jié)果相一致。該實驗結(jié)果也表明MuMADS1和MuUBA在不同的組織和果實的不同發(fā)育時期中的表達具有協(xié)同一致性。

香蕉是一種典型的躍變型果實，其成熟過程在很大程度上受到外源乙烯的促進及1-MCP的抑制作用，1-MCP作為乙烯的競爭性抑制劑，競爭性結(jié)合乙烯受體[15]。本研究中，當(dāng)用外源乙烯處理香蕉果實時MuMADS1及MuUBA的表達水平都極大增加，并且發(fā)現(xiàn)相對于自然成熟的果實分別提前7 d和16 d達到表達高峰。經(jīng)過1-MCP處理，MuMADS1及MuUBA表達大大受到抑制，在采后0～25d后沒有出現(xiàn)明顯的表達高峰。這種變化同香蕉果實成熟過程是一致的，表明MuMADS1和MuUBA的表達受外源乙烯共同調(diào)節(jié)，其在香蕉果實成熟中具有關(guān)鍵作用。另外，本研究結(jié)果表明，MuUBA對于乙烯信號的響應(yīng)速度比MuMADS1快（圖3）。基于這兩種蛋白相互作用的研究結(jié)果，筆者推測MuUBA可以通過翻譯后修飾作用來調(diào)節(jié)MuMADS1的表達。

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