任緒瑞 劉艷玲 楊美 陳媛媛 王冬良 陳友根

摘 要 利用單因素分析法對(duì)影響菰SRAP-PCR擴(kuò)增效果的Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、DNA模板和引物濃度5種因素進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：建立了適合菰基因組的SRAP-PCR的體系：1 μL 10×Buffer、0.5 U Taq DNA聚合酶、2 mmol/L MgCl2、50 ng模板DNA、0.20 mmol/L dNTPs、正反向引物的濃度各為0.7 μmol/L，共10 μL。選取5對(duì)引物，利用該體系對(duì)72份菰樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共獲得132條清晰的譜帶，其中91條具有多態(tài)性，比率為68.9%。菰SRAP-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化和建立將為利用該標(biāo)記進(jìn)行種質(zhì)遺傳多樣性分析和連鎖圖譜構(gòu)建等研究提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 菰；SRAP；PCR反應(yīng)體系；優(yōu)化

中圖分類號(hào) S511.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

SRAP（Sequence-related amplified polymorphism，序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性）是一種不同于RAPD、SSR、AFLP、SNP的分子標(biāo)記方法，由美國(guó)加州大學(xué)作物系的Li等[1]于2001年從蕓苔屬（Brassica L.）植物中研發(fā)而來(lái)。該標(biāo)記因具有穩(wěn)定、簡(jiǎn)單和易于測(cè)序等特性而被廣泛應(yīng)用于植物的品種鑒定[2]、遺傳多樣性分析[3]、遺傳圖譜構(gòu)建[4-5]等研究，其研究對(duì)象涉及果樹[6]、蔬菜[7-8]和糧食作物[9]等。

菰（Zizania latifolia Turcz.），是稻族（Oryzeae）菰屬（Zizania L.）的多年生挺水禾草，具有廣泛的利用價(jià)值。菰的莖葉是優(yōu)良的飼料，其嫩莖經(jīng)過(guò)黑粉菌（Ustilago esculenta P. Henn）感染后成為中國(guó)重要的水生蔬菜茭白[10]。由于菰和水稻（Oryza sativa L.）親緣關(guān)系較近，且菰具有高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是水稻品種改良的重要種質(zhì)資源[11]。野生菰分布廣泛，在許多濕地中是優(yōu)勢(shì)種或建群種[12]，對(duì)于湖岸帶的穩(wěn)定具有重要的生態(tài)功能。雖然野生菰資源具有重要的育種價(jià)值和生態(tài)功能，目前關(guān)于菰野生種群的遺傳多樣性研究卻十分有限，應(yīng)用的標(biāo)記有Adh1a序列[13]和SSR標(biāo)記[14]。SRAP作為一種新型分子標(biāo)記，雖然在菰品種資源的遺傳變異分析中得到初步應(yīng)用，但其擴(kuò)增條帶產(chǎn)率和多態(tài)比率都較低[15]，其反應(yīng)體系尚需優(yōu)化。為了有效運(yùn)用SRAP標(biāo)記研究野生菰資源的遺傳變異，本研究以取自長(zhǎng)江中下游和東北三江平原的2份野生菰為材料，對(duì)適合菰的SRAP-PCR分析反應(yīng)體系進(jìn)行了探討，為菰種質(zhì)資源分析、遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 所用2個(gè)菰（Z. latifolia）材料分別選自長(zhǎng)江中下游的龍感湖（N 30°13′48"，E 116°15′40"）和三江平原黑龍江沿岸（N 49°12′15"，E 129°43′27"）。采集樣本的健康幼嫩葉片，放入裝有硅膠的密封袋中干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 由加拿大Fermentas MBI公司生產(chǎn)的10×Taq Buffer（不含MgCl2），5 U/μL Taq DNA polymerase，25 mmol/L MgCl2；由瑞士Roche試劑公司生產(chǎn)的10 mmol/L dNTPs；由美國(guó)Promega公司生產(chǎn)的DNA Marker；美國(guó)Amresco公司生產(chǎn)的CTAB、Tris-base、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、TEMED。SRAP標(biāo)記引物參照Li等[1]，所選引物序列見表1，由上海桑尼生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，稀釋至10 μmol/L備用。

1.2 方法

1.2.1 菰基因組DNA提取與檢測(cè) 采用改良的CTAB方法[16]提取植物基因組總DNA；用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad Gel Doc XR+）觀察檢測(cè)DNA質(zhì)量，通過(guò)紫外分光核酸測(cè)定儀（NanoDrop Lite Spectrophotometer）測(cè)定DNA濃度。

1.2.2 SRAP反應(yīng)體系優(yōu)化 對(duì)影響擴(kuò)增的Mg2+、dNTPs、DNA模板、Taq DNA聚合酶、引物5個(gè)因子進(jìn)行單因子試驗(yàn)，在反應(yīng)體系中其它成分不變的情況下，將每個(gè)因子設(shè)置4個(gè)梯度（表2）。PCR反應(yīng)體積為10 μL，基礎(chǔ)反應(yīng)體系為：模板DNA 50 ng，dNTPs 0.2 mmol/L，10×Buffer緩沖液1 μL，MgCl2 2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，正反引物各0.7 μmol/L。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 本實(shí)驗(yàn)使用Bio-Rad MyCycler Thermal Cycler PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)參考Li等[1]的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè) 于PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加5 μL的上樣緩沖液，94 ℃變性5 min后，取樣2.5 μL用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，緩沖液為0.5×TBE，以47 W恒功率電泳1.5 h（JY3000高壓電泳儀）。取下膠板后置于1 g/L的AgNO3中浸泡15 min，并以去離子水快速?zèng)_洗5 s，然后浸入1.5 L的顯影液（6 ml甲醛+0.6 g Na2CO3+30 g NaOH）中搖5 min。最后用流水沖洗干凈。

2 結(jié)果與分析

2.1 菰基因組DNA質(zhì)量的檢測(cè)

所提取菰基因組DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示2份菰材料的DNA條帶清晰（圖1）。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)顯示，長(zhǎng)江中下游龍感湖和東北三江平原黑龍江樣本DNA的A260/A280分別為1.987和1.973，A260/A230比值為2.011和2.032， 能夠滿足SRAP標(biāo)記技術(shù)對(duì)DNA質(zhì)量的要求。2樣本的DNA濃度分別為693.6、831.9 ng/μL。

2.2 各因子對(duì)SRAP-PCR反應(yīng)結(jié)果的影響

2.2.1 模板濃度 在本試驗(yàn)中，不同濃度的模板DNA普遍擴(kuò)增較好（圖2），但模板為20 ng時(shí)，me2em1 B1和me6em3 A1少數(shù)條帶擴(kuò)增較弱，me2em1 A1、me8em1 A1條帶的背景較深；模板為35 ng時(shí)，me6em3和me8em1所擴(kuò)增條帶亮度有所增強(qiáng)，帶型比較清晰，但me2em1和me6em1條帶的背景比較深；模板DNA為50 ng時(shí)，5對(duì)引物的擴(kuò)增效果均比前2種DNA模板用量的效果好，尤其是樣本A，A3的條帶要比A1、A2、A4更清晰；模板為65 ng時(shí)，me2em1 A4、me6em1 A4、me8em1 A4條帶的背景較深。通過(guò)比較5對(duì)引物在不同模板DNA用量下擴(kuò)增的穩(wěn)定性，確定最佳DNA用量為50 ng。

2.2.2 Mg2+濃度 從圖3中可以看出，Mg2+對(duì)PCR的影響很大。Mg2+濃度為1.0 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)目較少，帶型清晰度不夠，如me2em1 A1在145 bp和200 bp處缺少擴(kuò)增條帶，me6em1 A1在300、180、160 bp處缺少擴(kuò)增條帶；隨著Mg2+濃度增加，擴(kuò)增條帶數(shù)目加強(qiáng)，帶型清晰度增加；當(dāng)Mg2+濃度為1.5 mmol/L時(shí)，me2em1 B2、me6em1 A2和me8em1A2、B2均有非特異擴(kuò)增的條帶出現(xiàn)；Mg2+為2.0 mmol/L時(shí)擴(kuò)增效果最好；當(dāng)Mg2+的濃度達(dá)到2.5 mmol/L時(shí)，me5em4 B4、me8em1 B4帶型的清晰度有所降低。5對(duì)引物組合中，Mg2+濃度變化對(duì)me2em1的影響最為明顯。

2.2.3 dNTPs濃度 由圖4可見，4種不同濃度的dNTPs對(duì)PCR都產(chǎn)生有效的擴(kuò)增，只是隨著濃度的增加，特異性有所增強(qiáng)，特別是在龍感湖的樣本中比較明顯。dNTPs濃度為0.1 mmol/L時(shí)，條帶清晰，但是相對(duì)較弱，部分條帶有缺少的現(xiàn)象，如me6em3 A1在170 bp處缺少條帶；濃度為0.15 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶數(shù)目較多；濃度為0.20 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶多，帶型清晰，多態(tài)性最好，在me6em3、me8me1這2對(duì)引物的擴(kuò)增中尤為明顯；濃度上升到0.25 mmol/L時(shí)，條帶清晰度開始降低，me6em3 B4在127、150 bp處，me8em1 B4在110 bp處有條帶缺失的現(xiàn)象。因此確定最佳dNTPs濃度為0.20 mmol/L。

2.2.4 Taq DNA聚合酶用量 由圖5可以看出，不同濃度的Taq DNA聚合酶擴(kuò)增的條帶亮度相差不是特別明顯。但是Taq DNA聚合酶用量為0.25 U時(shí)，有少數(shù)個(gè)體擴(kuò)增的條帶數(shù)目減少，例如me8em1 A1在350 bp處有條帶缺失的現(xiàn)象；當(dāng)用量為0.50 U時(shí)，條帶增多，帶型穩(wěn)定清晰；用量為0.75、1.0 U時(shí)，me8em1 A3、A4、B3、B4帶型彌散不清晰。本著節(jié)約的原則，選擇最佳Taq DNA聚合酶用量為0.5 U。

2.2.5 引物濃度 本研究中4種引物濃度下的PCR擴(kuò)增效果相差不大（圖6），條帶均比較清晰。具體分析如下：當(dāng)體系的引物濃度為0.4 μmol/L時(shí)，條帶較弱且背景較深，如me2em1 A1、me5em4 A1；當(dāng)引物濃度為0.7 μmol/L時(shí)，帶型清晰，亮度增加；當(dāng)增加至1.0 μmol/L時(shí)，me6em1 A3、B3、me5em4 A3、B3的條帶模糊，背景加深；引物濃度為1.3 μmol/L時(shí)，部分引物如me6em A3、A4的帶型清晰，但在其他居群及引物組合中擴(kuò)增效果不好。因此最佳的引物濃度為0.7 μmol/L。

2.3 SRAP-PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證

根據(jù)前面各濃度的單因素梯度實(shí)驗(yàn)可以得到適合菰SRAP-PCR的反應(yīng)體系為：MgCl2 2 mmol/L、DNA 50 ng、Taq DNA聚合酶0.5 U、dNTPs 0.2 mmol/L、正反引物濃度均為0.7 μmol/L，總體積為10 μL。為了檢測(cè)該體系的穩(wěn)定性，選用5對(duì)引物（me2em1、me6em1、me6em3、me5em4和me8em1），采用該優(yōu)化體系對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的72份菰樣進(jìn)行了擴(kuò)增（圖7）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，5對(duì)引物共獲得132條清晰的譜帶，其中91條具有多態(tài)性，比率為68.9%。表明建立的反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，可用于進(jìn)一步的遺傳分析。

3 討論與結(jié)論

作為基于PCR的分子標(biāo)記技術(shù)，SRAP與其它PCR技術(shù)相似，其擴(kuò)增結(jié)果易受反應(yīng)體系中多種因素的影響[17-19]。如模板濃度低，模板與引物的結(jié)合率小而導(dǎo)致無(wú)擴(kuò)增帶，而濃度過(guò)高則會(huì)引起模板與模板結(jié)合率高，同樣引起其與引物結(jié)合率變小[20]；高濃度的Taq DNA酶會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，用量偏低又會(huì)導(dǎo)致新鏈合成的效率下降[21]；Mg2+濃度的變化會(huì)影響SRAP帶型的清晰度，從而影響酶的活性及產(chǎn)物合成的忠實(shí)性[22]。此外，引物和dNTPs 濃度等因素也會(huì)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生較大影響，因而優(yōu)化SRAP-PCR反應(yīng)的條件是獲得可靠結(jié)果的關(guān)鍵。本試驗(yàn)對(duì)Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板5種組分進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)Mg2+對(duì)擴(kuò)增的結(jié)果影響最大，另外4種因子對(duì)擴(kuò)增結(jié)果也有一定程度的影響，這與對(duì)中國(guó)蘭[23]、紅松[24]、石蒜[25]的研究結(jié)果相似。另外，也有研究顯示在觀賞海棠[26]、蓮[20]的SRAP-PCR中，dNTPs、Taq酶均是擴(kuò)增的最大影響因子，表明植物的基因組差異可能導(dǎo)致擴(kuò)增體系存在差異。

本研究利用5對(duì)引物組合共獲得132個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)有91個(gè)（占68.9%），其擴(kuò)增產(chǎn)率和多態(tài)性比率與以往對(duì)蓮[20]、木瓜[27]、蔥[28]的研究相似。丁潮洪等[15]曾利用SRAP標(biāo)記對(duì)收集于浙江省的35份菰栽培品種和地方品系進(jìn)行擴(kuò)增，然而其擴(kuò)增產(chǎn)率和多態(tài)率明顯偏低，利用47對(duì)引物僅獲得153個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)11個(gè)（占7.2%）。除了擴(kuò)增反應(yīng)體系的不同外，這2項(xiàng)研究在擴(kuò)增產(chǎn)率上存在的巨大差異也許與反應(yīng)程序有很大相關(guān)性。本研究的PCR擴(kuò)增所用程序參照Li等[1]，最初5個(gè)循環(huán)退火溫度為35 ℃，可使引物與模板易于結(jié)合，隨后35個(gè)循環(huán)的退火溫度升高為50 ℃，保證了結(jié)果的可重復(fù)性和擴(kuò)增產(chǎn)率。在丁潮洪等[15]的研究中，后來(lái)循環(huán)的退火溫度為53 ℃，雖然退火溫度的升高會(huì)使結(jié)果更加穩(wěn)定，但這將會(huì)大幅度降低擴(kuò)增條帶的數(shù)目。另外，本研究所選的實(shí)驗(yàn)樣本分別來(lái)源于東北和長(zhǎng)江中下游的野外種群，其遺傳背景差異較大，因而相對(duì)于菰的栽培品種會(huì)顯示出更高的多態(tài)性。

綜上所述，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，本研究確定了菰SRAP-PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系為：MgCl2 2 mmol/L，模板DNA 50 ng，Taq DNA聚合酶0.5 U，dNTPs 0.2 mmol/L，正反向引物濃度均為0.7 μmol/L，共10 μL。檢驗(yàn)表明，利用此反應(yīng)體系擴(kuò)增譜帶清晰、多態(tài)性高且穩(wěn)定性好。本研究為菰的種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位等研究奠定基礎(chǔ)，為后續(xù)的研究提供了較好的技術(shù)支持。

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