王珊珊 蘇亞春 楊玉婷 郭晉隆 許莉萍

摘 要 以甘蔗（Saccharum spp. hybrid）抗黑穗病基因型崖城05-179為材料，采用同源克隆法獲得了1個(gè)幾丁質(zhì)酶基因全長cDNA序列（GenBank登錄號(hào)為KF279661），命名為ScChiⅦ1，序列長907 bp，編碼299個(gè)氨基酸，屬于糖苷水解酶第19家族，預(yù)測為胞外分泌蛋白且兼具溶菌酶活性。聚類分析顯示，該基因與其他植物ClassⅦ幾丁質(zhì)酶基因聚為一類?；蚪M序列（GenBank登錄號(hào)為KF279662）分析顯示，該基因含有2個(gè)長度分別為615 bp和86 bp的內(nèi)含子。實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果表明，甘蔗黑穗病菌脅迫下，ScChiⅦ1在抗?。ㄑ鲁?5-179）和感病基因型（柳城03-182）中差異表達(dá)，推測ScChiⅦ1可能參與黑穗病菌脅迫的防御反應(yīng)。組織特異性表達(dá)分析結(jié)果顯示，ScChiⅦ1在甘蔗葉、芽、皮、肉、根中均有表達(dá)，但在芽中表達(dá)量最高，推測與該病原從蔗芽侵入有關(guān)。研究結(jié)果為進(jìn)一步研究甘蔗幾丁質(zhì)酶基因功能及甘蔗與黑穗病菌互作機(jī)制提供了有益的信息。

關(guān)鍵詞 甘蔗；幾丁質(zhì)酶；克??；生物信息學(xué)分析；黑穗病菌；定量表達(dá)

中圖分類號(hào) S566.1；Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

甘蔗是最主要的糖料作物，全世界食糖產(chǎn)量的78%來自甘蔗[1]。病害是影響甘蔗產(chǎn)量和糖分的重要生物逆境，而真菌性病害是甘蔗生產(chǎn)上最重要的病害，其中甘蔗黑穗病（Sporisorium scitamineum）是我國蔗區(qū)最嚴(yán)重的病害之一，大量病原分生孢子由氣體傳播導(dǎo)致甘蔗黑穗病的再侵染和病害流行[2]。主栽品種新臺(tái)糖22號(hào)對(duì)黑穗病抗性差是導(dǎo)致我國黑穗病流行的主要原因，也是該品種宿根產(chǎn)量明顯下降的主要的原因[2]。公認(rèn)提高甘蔗品種抗病性是最經(jīng)濟(jì)有效的病害控制策略。長期以來，甘蔗主要依靠雜交育種來提高栽培品種的抗病性，但是，對(duì)遺傳背景為異源多倍體、非整倍體、基因組龐大、染色體達(dá)120條左右的甘蔗（栽培品種）而言，培育高產(chǎn)、高糖、抗病聚合基因型難度大。不僅需要龐大的雜交分離群體，且需要經(jīng)過10 年或更長時(shí)間的產(chǎn)量潛力、穩(wěn)定性和適應(yīng)性的鑒定與評(píng)價(jià)，一般育成優(yōu)良品種的概率極低，僅為1/250 000[3]?；谝陨希l(fā)掘功能基因或逆境應(yīng)答基因，以作為后續(xù)轉(zhuǎn)基因改良的目的基因或進(jìn)一步開發(fā)標(biāo)記輔助選擇與評(píng)價(jià)技術(shù)的基礎(chǔ)，對(duì)甘蔗聚合育種而言無疑是重要的。

幾丁質(zhì)酶（EC.3.2.1.14）是一種糖苷水解酶。該酶通過催化降解病原真菌細(xì)胞壁的主要成分幾丁質(zhì)，從而抑制真菌的生長與繁殖[4]。正常情況下，植物體內(nèi)幾丁質(zhì)酶的含量很低，但當(dāng)植物受到外源脅迫因子如病原細(xì)菌、真菌或病毒侵染后，其表達(dá)量迅速提高，van-kan J A 等[5]在研究番茄與真菌性病原葉霉病菌（Cladosporium fulvum）的互作時(shí)，就發(fā)現(xiàn)了該現(xiàn)象。Broglie等[6]最早通過分子雜交的方法，從菜豆（Phaseolus vulgaris）的cDNA中分離到幾丁質(zhì)酶基因，并將其轉(zhuǎn)化到煙草（Nicotiana tabacum）中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化后的植株對(duì)立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）的抗性高于對(duì)照組，這是植物幾丁質(zhì)酶基因克隆與功能鑒定的首例報(bào)道。目前，已從水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、菜豆等近100種植物中，克隆到了幾丁質(zhì)酶基因，這些基因分別屬于幾丁質(zhì)酶家族的不同類型[7-8]。近年來，利用外源幾丁質(zhì)酶基因?qū)胫参镆栽鰪?qiáng)抗病性的成功事例較多。番茄（Solanum lycopersicum）、小麥（Triticum aestivum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）和香蕉（Musa paradisiaca）等多種植物已獲得了轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因的植株[9-12]。顧麗紅等[13]將帶有修飾過的煙草Ⅰ類幾丁質(zhì)酶基因和Ⅰ類β-1， 3-葡聚糖酶基因的雙價(jià)植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，轉(zhuǎn)化甘蔗品種“ROC”10和“ROC”22，轉(zhuǎn)基因后代對(duì)甘蔗黑穗病的抗性得到不同程度的提高。但迄今，從GenBank檢索到的甘蔗幾丁質(zhì)酶核酸序列有4個(gè)，相關(guān)EST 也僅有3條，有關(guān)甘蔗幾丁質(zhì)酶抗病研究僅有2例報(bào)道，都是涉及甘蔗與甘蔗梢腐病原菌（Colletotrichum falcatum或Gibberella fujikuroi）的生物互作系統(tǒng)，其中Sheng Lin等[14]用真菌病原菌Gibberella fujikuroi接種果蔗，對(duì)接種0 h和48 h以后的葉片從蛋白質(zhì)組學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行研究，并發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶在48 h時(shí)表達(dá)量最大，作者認(rèn)為果蔗幾丁質(zhì)酶對(duì)Gibberella fujikuroi有一定抗性；Rahul等[15]從接種甘蔗梢腐病原菌后的抗病（Co 93009）和感?。–oC 671）品種分離得到了2個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)酶基因在抗病品種的表達(dá)水平較高。

本研究借助同源克隆方法，從甘蔗中分離獲得幾丁質(zhì)酶基因的全長cDNA和基因組序列。而后，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件，對(duì)基因所編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測分析。同時(shí)，借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，初步研究了該基因的組織表達(dá)情況及其在黑穗病菌脅迫下的表達(dá)模式。為進(jìn)一步研究甘蔗幾丁質(zhì)酶基因在抗病育種中的作用，提供一定的基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 甘蔗基因型（Saccharum spp. hybrid）崖城05-179和柳城03-182來自國家甘蔗產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心的甘蔗資源工作圃，供試的甘蔗黑穗病菌采自柳城03-182。實(shí)驗(yàn)取崖城05-179和柳城03-182生長健壯、長勢一致的蔗莖，砍成雙芽段后，采用前人[16]類似方法進(jìn)行催芽培養(yǎng)，即在清水浸泡24 h，然后置于程控光照培養(yǎng)箱中，采用光照12 h和黑暗12 h交替的方式培養(yǎng)，相對(duì)濕度65%，溫度為32 ℃。待蔗芽長至2 cm后，以5×106 個(gè)/mL甘蔗黑穗病菌孢子懸浮液針刺接種蔗芽后，在28 ℃下培養(yǎng)，其他條件不變。同時(shí)，對(duì)照處理以注射無菌水代替黑穗病菌，方法參照文獻(xiàn)[17]，分別于接種后的第0、6、12、24和48 h，各取5個(gè)單芽，迅速用液氮固定，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?duì)于甘蔗不同組織部位材料的采集，從田間隨機(jī)選取5株新植的成熟期甘蔗，表觀健康、長勢一致的崖城05-179，清水洗凈根部泥土，收集白色嫩根，并從地上部位的完整蔗節(jié)算起，截取第七和第八節(jié)蔗莖節(jié)間的蔗芽、蔗皮和蔗髓，以及甘蔗+1葉，所有材料立即放入液氮速凍，再放置在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 pMD18-T載體、TAKALA Ex Taq和Prime Script RT-PCR Kit購自TaKaRa公司；E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I質(zhì)粒提取試劑盒、DNA快速純化/回收試劑盒購自O(shè)MEGA生物科技公司；TrizolR Reagent試劑購自Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑購自Roche公司；Marker、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 按TrizolR Reagent說明書，分別提取崖城05-179和柳城03-182接種黑穗病菌后第0、6、12、24和48小時(shí)的蔗芽總RNA。取1.0 μL RNA樣品，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。參照Prime Script RT-PCR Kit操作說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，并用紫外分光光度計(jì)測定cDNA濃度，最后將各處理cDNA濃度稀釋至同一濃度。

1.2.2 基因組DNA提取 參照姚偉等[18]的方法，采用CTAB法提取崖城05-179蔗芽基因組DNA，1.0%電泳檢測DNA質(zhì)量后，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)同源克隆方法，搜索同源物種高粱基因組數(shù)據(jù)庫中推定的幾丁質(zhì)酶基因序列（GenBank登錄號(hào)為XM_002445832），應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物，上游引物ScChiⅦ1F：5′-ATGTCCGGGACGCGA-3′，下游引物ScChiⅦ1R：5′-CATATTCTTAGAAGTCAGAACTCT-3′，引物送上海捷瑞生物有限公司合成。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 分別以崖城05-179接種黑穗病菌48 h的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和崖城05-179蔗芽基因組DNA為模板，以ScChiⅦ1F和ScChiⅦ1R為引物進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系參照TAKALA Ex Taq說明書，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；35個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增（94 ℃，30 s； 60 ℃，45 s；72 ℃，1 min）；72 ℃，再延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR驗(yàn)證后，再送上海生物工程技術(shù)有限公司測序。

1.2.5 甘蔗幾丁質(zhì)酶基因生物信息學(xué)分析 利用在線軟件SignalP4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行幾丁質(zhì)酶基因蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析；借助Scanprosite（http：//www.expasy.ch/tools/scanprosite/）軟件，分析蛋白質(zhì)的序列結(jié)構(gòu)和家族歸類；利用Psort（http：//psort.hgc.jp/form.html）程序，進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用NPS@網(wǎng)站（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）和SWISS-MODEL生物軟件，分別進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用Blast在線軟件，將測序結(jié)果與其他植物幾丁質(zhì)酶基因的核酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析；聚類分析中涉及的擬南芥和水稻幾丁質(zhì)酶基因的氨基酸序列從GenBank中獲得，并借助Vector NTI軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.6 基因表達(dá)分析 根據(jù)克隆獲得的甘蔗幾丁質(zhì)酶基因的ORF序列，設(shè)計(jì)特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，上游引物ScChiⅦ1QF：5′-TACAACCA

CGAATTGAGCCR-3′，下游引物ScChiⅦ1QR：5′-TAGCACCAAAGCCAGGATA-3′。以GAPDH基因（上游引物：5′-CACGGCCACTGGAAGCA-3′和下游引物：5′-TCCTCAGGGTTCCTGATGCC-3'）作為內(nèi)參基因[19-21]。定量反應(yīng)體系按照SYBR Green說明書，定量PCR擴(kuò)增在7 500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI，USA）上完成。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。擴(kuò)增程序如下：50 ℃，2 min；40個(gè)循環(huán)PCR擴(kuò)增（95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min）。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行融解曲線分析。采用2-△△CT算法分析基因表達(dá)水平[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗幾丁質(zhì)酶基因的克隆鑒定

根據(jù)特異性引物進(jìn)行cDNA的PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果見圖1-a，顯示在900～1 000 bp間有明顯的擴(kuò)增帶，與預(yù)期目標(biāo)片段產(chǎn)物條帶大小相符。將該片段回收純化后，選擇經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌液PCR檢測鑒定為陽性的克隆，進(jìn)行測序。測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)其與其他植物幾丁質(zhì)酶基因具有很高的相似性，初步推斷該序列為甘蔗幾丁質(zhì)酶基因，命名為ScChiⅦ1，GenBank登錄號(hào)為KF279661。其基因組序列擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果見圖1-b，測序顯示獲得一條長1 608 bp的核酸序列，GenBank登錄號(hào)為KF279662。

2.2 ScChiⅦ1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 ScChiⅦ1基因核酸序列和氨基酸序列分析 對(duì)ScChiⅦ1基因進(jìn)行核酸序列分析，結(jié)果顯示（圖2），該基因cDNA全長907 bp，包含1個(gè)900 bp的完整開放閱讀框（ORF），起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，共編碼299個(gè)氨基酸?；蚪M克隆分析顯示其含有2個(gè)內(nèi)含子，分別為615 bp和86 bp，且均符合“GT-AG”內(nèi)含子法則。ScChiⅦ1基因推導(dǎo)的編碼蛋白，帶正電的氨基酸（D、E）29個(gè)，帶負(fù)電的氨基酸（R、K）33個(gè)。采用在線軟件ExPASy中的ProtParam，預(yù)測推導(dǎo)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為33.06 ku，理論等電點(diǎn)為6.08，表明該蛋白是一種酸性蛋白。

2.2.2 ScChiⅦ1基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 ScChiⅦ1編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示該蛋白無規(guī)則卷曲所占比例最高（54.85%），其次是α螺旋結(jié)構(gòu)（25.08%），延伸鏈和β折疊分別占13.38%和6.69%。

2.2.3 ScChiⅦ1編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 以3w3eB（1.50 A）為參考模型，對(duì)ScChiⅦ1編碼蛋白進(jìn)行建模分析，結(jié)果如圖3，可知ScChiⅦ1蛋白的空間結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，這與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果相吻合。將ScChiⅦ1空間構(gòu)象模擬圖與水稻（NP_001062281.1）、小麥（EMS53119.1）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon XP_003572384.1）的模擬圖進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)螺旋等空間結(jié)構(gòu)特點(diǎn)基本相同。

2.2.4 ScChiⅦ1編碼蛋白的亞細(xì)胞定位 Psort軟件分析顯示ScChiⅦ1基因編碼蛋白分泌到胞外的概率為67.6%，存在微體或過氧化物體中的概率為23.0%，存在于溶酶體中的概率為19.0%，推測其為分泌蛋白。

2.2.5 ScChiⅦ1編碼蛋白的信號(hào)肽預(yù)測 借助SignalP4.1 Server在線軟件，預(yù)測ScChiⅦ1蛋白的信號(hào)肽（圖4），顯示在該蛋白氨基酸序列的第22～23位氨基酸上，有1個(gè)潛在的信號(hào)肽斷裂位點(diǎn)，概率為92.9%，同時(shí)，C（原始剪切位點(diǎn)的分值）最大值、Y（綜合剪切位點(diǎn)的分值）最高峰和S（信號(hào)肽的分值）最大值位于同一個(gè)區(qū)域，因此，推測ScChiⅦ1蛋白具有信號(hào)肽，其信號(hào)肽序列為MSGTRGAALLLLLLVTSAAAGG，從第23個(gè)氨基酸開始則為成熟蛋白質(zhì)。

2.2.6 ScChiⅦ1編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域及功能預(yù)測 經(jīng)Blast比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)ScChiⅦ1蛋白序列存在保守結(jié)構(gòu)域（圖5），從第110位-154位氨基酸區(qū)域是幾丁質(zhì)酶典型的催化域，屬于糖苷水解酶第19家族。同時(shí)，ScChiⅦ1編碼蛋白具有與溶菌酶超家族基因相似的保守結(jié)構(gòu)域，因此，推測該基因兼具溶菌酶活性。

2.2.7 ScChiⅦ1同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 植物幾丁質(zhì)酶基因是家族基因，將本研究中克隆到的ScChiⅦ1基因與水稻（O. sativa NP_001062281.1）、小麥（T. aestivum EMS53119.1）、二穗短柄草（B. distachyon XP_003572384.1）、 綠蘿（Epipremnum au

reum BAI63079.1）、油棕（Elaeis guineensis AFV302

04.1）、 山羊草（Aegilops tauschii EMT31181.1）等的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行同源性比對(duì)，其氨基酸的同源性分別為86%、85%、82%、73%、71%和70%（圖6）。借助Vector NTI軟件，將ScChiⅦ1編碼蛋白與在TAIR（http：//www.arabidopsis.org/）數(shù)據(jù)庫中搜索到的23個(gè)擬南芥幾丁質(zhì)酶基因及從NCBI中下載的25個(gè)已知的其他植物幾丁質(zhì)酶的氨基酸列[22]，構(gòu)建了N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7）。聚類結(jié)果顯示ClusterⅢ和ClusterⅤ聚為了一支， ScChiⅦ1被聚類在幾丁質(zhì)酶ClassⅦ。本研究中克隆到的ScChiⅦ1基因編碼蛋白的N-端含有一個(gè)22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，具有催化結(jié)構(gòu)域，但不含有幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)（Chitin-binding domain， CBD），缺少半胱氨酸和脯氨酸的可變交聯(lián)區(qū)，這與前人[23]有關(guān) ClassⅦ幾丁質(zhì)酶的研究結(jié)果一致。

2.3 甘蔗黑穗病菌脅迫下ScChiⅦ1基因的表達(dá)模式

病原菌侵染植物后，幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)錄水平的變化可以反映出該基因參與抗病反應(yīng)的時(shí)間早晚以及可能參與的防御反應(yīng)機(jī)制[24]。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，獲得了2個(gè)甘蔗基因型崖城05-179（抗?。┖土?3-182（感?。┰诤谒氩【秩?、6、12、24和48 h時(shí)間點(diǎn)ScChiⅦ1基因相對(duì)表達(dá)量的變化情況。從圖8中可以看出，ScChiⅦ1基因在不同基因型中差異表達(dá)，對(duì)于抗病基因型，總體呈現(xiàn)“先小幅下調(diào)后上調(diào)”的趨勢，在48 h時(shí)間點(diǎn)，該基因表達(dá)量開始上調(diào)；對(duì)于感病基因型，總體呈現(xiàn)“先大幅度下調(diào)，后上調(diào)，再小幅下調(diào)”的趨勢，在6 h時(shí)間點(diǎn)，該基因表達(dá)量最小，最高值則出現(xiàn)在接種后的24 h。總體上，ScChiⅦ1基因只是小幅應(yīng)答甘蔗黑穗病菌侵染的脅迫。

2.4 ScChiⅦ1基因在甘蔗不同組織中的表達(dá)特性

以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，獲得了ScChiⅦ1基因在甘蔗葉、芽、皮、髓和根中的相對(duì)表達(dá)量（圖9），顯示ScChiⅦ1在甘蔗上述組織中均有表達(dá)，但在芽中的表達(dá)量相對(duì)較高，約為蔗莖髓部組織中表達(dá)量的2倍，其次為葉和皮，分別為髓中表達(dá)量的1.67和1.48倍。

3 討論與結(jié)論

當(dāng)植物受到真菌侵染時(shí)，會(huì)誘發(fā)自身防御機(jī)制產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白，幾丁質(zhì)酶作為一類重要的病程相關(guān)蛋白（Pathogenesis-related protein，PR），已被從多種植物中克隆獲得并將其作為外源基因?qū)胫参镆栽鰪?qiáng)其抗病性[6-13]。植物幾丁質(zhì)酶的分類已修改多次[4]，目前的分類主要有2種，一種是把其分為6類，如許鳳華等人借助4個(gè)生物學(xué)軟件（SignalP3.0、TMHMM2.0、TargetP1.1和big-PiPredictor）將水稻的37個(gè)和擬南芥的24個(gè)幾丁質(zhì)酶基因聚為6類[22]；另一種是根據(jù)幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，把其分為7類[24]，其中第1個(gè)ClassⅦ幾丁質(zhì)酶基因是從陸地棉中克隆的，該基因與ClassⅠ、ClassⅡ同源性僅為30 %，N-端具有信號(hào)肽，但不含有CBD，同時(shí)缺少半胱氨酸和脯氨酸的可變交聯(lián)區(qū)[23]。值得注意的是：在本研究獲得的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹中，原歸入ClusterⅠ的幾丁質(zhì)酶基因AAB23692聚在ClusterⅣ，而擬南芥的2個(gè)幾丁質(zhì)酶基因（GenBank登錄號(hào)為At1g05850和At3g16920）聚在ClusterⅦ，另2個(gè)基因（GenBank登錄號(hào)為At1g 02360.1和At4g 01700.1）聚在ClusterⅠ，這與許鳳華等[22]的研究結(jié)論不相符，可能是由于聚類過程中所使用的分析軟件不同所引起的。

編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域及功能預(yù)測顯示，ScChiⅦ1蛋白屬于糖苷水解酶第19家族（圖5），這與植物幾丁質(zhì)酶分類中只有ClusterⅢ和ClusterⅤ屬于糖苷水解酶第18家族，其余類型屬于糖苷水解酶第19家族的結(jié)果也是一致的[25-27]。對(duì)于植物的ClassⅦ幾丁質(zhì)酶基因，在該基因的生物學(xué)活性研究方面，僅見Singh等[28]將從小麥中分離到1個(gè)ClassⅦ幾丁質(zhì)酶基因在E. coli BL21菌株中實(shí)現(xiàn)過表達(dá)，所獲得的純化重組蛋白在離體培養(yǎng)的抑菌實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)出了對(duì)甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、茶葉斑病菌（Pestalotia theae）、水稻鞘腐病菌（Sarocladium oryzae）、黑麥病菌（Fusarium sp.）和水稻粒變色病菌（Alternaria sp.）具有廣譜的抗性。此外，信號(hào)肽對(duì)于控制蛋白質(zhì)的分泌路徑和指導(dǎo)蛋白質(zhì)的定位有重要作用，一般位于分泌蛋白的N-端，由20多個(gè)氨基酸組成[3]，這與本研究對(duì)所獲得的ScChiⅦ1基因的信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果（22個(gè)氨基酸）是一致的。

前人[29]研究認(rèn)為，多數(shù)病原菌侵染植物是從細(xì)胞間隙開始的，病原菌侵入后，阻礙或破壞了植物組織攝取營養(yǎng)，影響了植物正常生長，因此，抗真菌蛋白最好在胞間表達(dá)更為有利抵御病原菌的侵染。本研究所克隆的ScChiⅦ1基因通過亞細(xì)胞定位，預(yù)測其分泌到胞外的概率較大（67.6%），推斷該基因如在甘蔗中超表達(dá)，其所表達(dá)的蛋白可能有助于直接參與對(duì)甘蔗黑穗病菌的防御作用。

幾丁質(zhì)酶基因是一種重要的PR基因，在植物受到病原侵染時(shí)，其表達(dá)量顯著增加。油菜（Brassica campestris）受到病原菌Phoma lingam侵染24 h后，抗病品種中Ⅳ型幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量是感病品種的3倍[30]。楊郁文等[30]報(bào)道了棉花（Gossypium hirsutum）受到枯萎和黃萎病原菌侵染后，棉花中Ⅲ型和Ⅳ型兩類幾丁質(zhì)酶基因在抗、感品種中的表達(dá)存在明顯差異，其中Ⅳ型僅在抗病品種中呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，而Ⅲ型還在棉花感病品種中受黃萎病菌誘導(dǎo)表達(dá)。本研究中，黑穗病菌侵染甘蔗后，ScChiⅦ1基因在抗感基因型中的表達(dá)模式也存在差異，抗病品種中呈現(xiàn)“抑-揚(yáng)”的表達(dá)模式，而在感病品種中則表現(xiàn)為“抑-揚(yáng)-抑”的表達(dá)模式。該研究結(jié)果與前人在棉花-枯黃萎病菌生物系統(tǒng)中的研究結(jié)果有一定的相似性和差異[30]，但與前人[31]研究幾丁質(zhì)酶在抗病品種中的表達(dá)量明顯高于感病品種的表達(dá)量的結(jié)論是不大一致的，推測可能是由于不同的植物-病原生物互作系統(tǒng)和所研究的幾丁質(zhì)酶基因類型不同所導(dǎo)致的。根據(jù)報(bào)道，病原菌誘導(dǎo)植物中幾丁質(zhì)酶的表達(dá)可能存在不同的機(jī)理，如Salzer等[32]在苜蓿菌根形成過程中，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型幾丁質(zhì)酶基因受病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)期不同，Ⅰ型和Ⅱ型幾丁質(zhì)酶基因是在成瘤的早期被誘導(dǎo)，而Ⅳ型則是在瘤成熟階段才被誘導(dǎo)。ScChiⅦ1基因的組織表達(dá)特異性分析表明，該基因在甘蔗不同器官（芽、 葉、 髓、 皮、 根）中均有表達(dá)，但在芽中的表達(dá)量最高，而前人[2]的研究顯示黑穗病菌侵染甘蔗的部位是蔗芽而非甘蔗葉片、蔗莖或根部，因此，推測ScChiⅦ1基因在蔗芽中的轉(zhuǎn)錄本積累可能起到參與防御黑穗病菌侵染的作用。

綜上所述，本研究采用同源克隆法，獲得了1個(gè)ClassⅦ甘蔗幾丁質(zhì)酶基因ScChiⅦ1（GenBank登錄號(hào)為KF279661）。該基因與已知的小麥、水稻等植物幾丁質(zhì)酶基因具有較高的同源性，定量分析顯示該基因參與了甘蔗黑穗病菌脅迫應(yīng)答，并在抗、感病性基因型中呈差異應(yīng)答模式，且在芽中表達(dá)量最高，考慮到該病原菌是從蔗芽侵入，推測該基因在抵御病原侵入以及侵入后的生物防御中起作用有關(guān)，但是具體功能及其作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。

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