張俊 王靜毅 陳友 馮慧敏 武耀廷 王沛政

摘 要 應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合structure軟件分析了32份香蕉種質(zhì)之間的遺傳關(guān)系。結(jié)果顯示32份香蕉群體分為4大亞群：本地大蕉群、ABB群（包含引進(jìn)大蕉亞群、粉蕉群）、AAA群及mix群。國(guó)內(nèi)大蕉與引進(jìn)大蕉遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)；粉蕉和大蕉各個(gè)品種之間存在豐富的遺傳多樣性；AAA群的皇帝蕉、Yangambi KM5和AAcv Rose栽培品種與我國(guó)早期引進(jìn)的主栽品種Williams遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)；本地大蕉群中的酸芭蕉（ABB）和東莞中把大蕉（ABB）與其它大蕉相聚較遠(yuǎn)；ABB群組中巨型大蕉（ABB）和FHIA-03（AABB）與該群中的其它品種相聚較遠(yuǎn)；華農(nóng)15和Williams沒(méi)有被區(qū)分開(kāi)，它們可能是同一克隆。研究結(jié)果表明基于模型的structure聚類分析也能用于遺傳多樣性分析。

關(guān)鍵詞 香蕉；SSR；Structure分析；聚類分析

中圖分類號(hào) S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

香蕉（Musa spp）是世界上產(chǎn)量最大的水果作物，在發(fā)展中國(guó)家是除水稻、小麥、玉米之外的第一大食物來(lái)源[1]。香蕉的主要栽培品種是由尖苞葉蕉（Musa acuminata Colla， A基因組）和長(zhǎng)梗蕉（M. balbisiana Colla， B基因組）這2個(gè)原始野生蕉種內(nèi)、蕉種間雜交或變異進(jìn)化而成的[2]。香蕉分為鮮食香蕉（dessert bananas）和熟食香蕉（cooking bananas or plantains）。根據(jù)植株形態(tài)上的特征及經(jīng)濟(jì)性狀，我國(guó)習(xí)慣上把鮮食香蕉品種分為香牙蕉（AAA）、大蕉（ABB）、粉蕉（ABB）和龍牙蕉（AAB）等，并通稱為香蕉。香蕉種質(zhì)資源豐富，種類品種繁多，具有特殊的生物學(xué)特性（如多倍體、無(wú)性繁殖、營(yíng)養(yǎng)結(jié)實(shí)、小染色體等），除三倍體外，還有二倍體和四倍體品種（系）。其種質(zhì)資源的系統(tǒng)學(xué)研究一直是個(gè)難題，這不但阻礙了香蕉種質(zhì)資源的合理利用，也影響香蕉的品種改良與育種。

國(guó)內(nèi)外香蕉種質(zhì)遺傳多樣性研究已有不少報(bào)道。Gawel等[3]報(bào)道了利用RFLP技術(shù)對(duì)香蕉屬的19個(gè)種和亞種的分類和系統(tǒng)發(fā)育的研究。Howell等[4]利用RAPD引物對(duì)9個(gè)栽培蕉種質(zhì)系統(tǒng)分析認(rèn)為AA、AAA、AAB、ABB和BB 5種基因型能反映出所研究的栽培種的特征。國(guó)內(nèi)冀小蕊等[5]利用SSR分子標(biāo)記發(fā)現(xiàn)引進(jìn)的香蕉種質(zhì)包括A和AB基因中均存在有遺傳差異較大的亞群。利用RAPD標(biāo)記陳源等[6]對(duì)福建香蕉種質(zhì)資源的基因組的聚類分析結(jié)果與傳統(tǒng)Simmonds分類法的結(jié)果一致。

Structure軟件中的多樣性分析方法是一種基于模型的聚類方法（貝葉斯聚類方法對(duì)群體進(jìn)行分類）。其原理是：假設(shè)群體中含有K個(gè)類群（K是未知的），這些類群在每個(gè)位點(diǎn)上都具有一套不同的等位基因頻率。該軟件可以分析多種分子標(biāo)記（SSR、RFLP、SNP等）。不僅可以分析群體的遺傳多樣性，同時(shí)亦能用于分析群體遺傳結(jié)構(gòu)等。在此基礎(chǔ)上可以分析標(biāo)記的連鎖不平衡類群和進(jìn)行性狀與標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析作圖[7-11]。Structure軟件在人類和動(dòng)物的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)中研究應(yīng)用廣泛[12-18]，目前尚未見(jiàn)利用structure軟件研究香蕉親緣關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)的報(bào)道。本研究基于香蕉種質(zhì)資源的SSR分子數(shù)據(jù)，利用structure軟件分析香蕉種質(zhì)的親緣關(guān)系，為香蕉資源分類研究和合理利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉葉片樣品取自廣州農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所國(guó)家香蕉種質(zhì)圃和中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所香蕉種質(zhì)圃（表1）。

1.2 DNA的提取以及SSR標(biāo)記鑒定

DNA提取采用CTAB方法[19]。PCR反應(yīng)、聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染方法參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行。結(jié)果用“1”和“0”記錄帶的有或無(wú)，“-9”表示條帶缺失。

1.3 群體結(jié)構(gòu)分析

用Structure 2.3軟件[21]來(lái)分析群體結(jié)構(gòu)及其遺傳多樣性分析，估計(jì)最佳群體組群數(shù)K，軟件中K取值范圍設(shè)置1～8，7次重復(fù)，采用admixture model，計(jì)算ΔK值[22]作為衡量最佳K值的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體結(jié)構(gòu)分析

SSR標(biāo)記多態(tài)性分析的結(jié)果見(jiàn)王靜毅等[23]。基于SSR標(biāo)記的371條差異條帶的基因型作為群體結(jié)構(gòu)分析的數(shù)據(jù)，利用structure軟件參照ΔK的算法[22]對(duì)32份香蕉材料群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果從圖1可以看出，當(dāng)k=3時(shí)，ΔK達(dá)到最大。依據(jù)k=3時(shí)Simulation Result中的bar plot可以繪制各品種在各群中所占比例（圖2）。圖2可以看出，利用structure軟件分析，32份香蕉材料分成3大類群，分別用3種顏色來(lái)表示。柱狀圖描述的是不同品種被分到這三類群中所占比例。圖中可以看出，大部分品種的分類與基因型分類一致，即表現(xiàn)出structure分類結(jié)果與傳統(tǒng)Simmonds分類結(jié)果的一致性，但也存在著一定的差異性。在Simulation Result中（表2）可以得到k=3時(shí)，各品種被分配到各群體中的概率Q值，將同一類群下Q≥0.70的品種劃分到一組。

2.2 品種的遺傳多樣性分析

利用structure軟件分析得到的聚類三角圖（圖3）。圖中的3個(gè)頂點(diǎn)代表了3個(gè)群組（本地大蕉群組、ABB群組、AAA群組），圖中具有相同顏色的點(diǎn)代表相似的基因型，點(diǎn)與點(diǎn)之間的二維距離衡量品種之間的遺傳距離。從圖中可以看出，32份香蕉種質(zhì)之間存在著豐富的遺傳多樣性。根據(jù)Q值劃分到ABB群組中的m42（巨型大蕉ABB）和m59（FHIA-03 AABB）與該群中的其它品種遺傳距離較遠(yuǎn)；本地大蕉群中的m41（酸芭蕉ABB）和m46（東莞中把大蕉ABB）與其它大蕉遺傳距離較遠(yuǎn)；AAA群組中的m1、m4、m8和m32單獨(dú)聚到一起（AA亞組）。三角圖中間的m60、m2、m55、m56由于與三個(gè)類群差異較大，被聚為Mix群。

2.3 香蕉種質(zhì)的親緣關(guān)系分析

經(jīng)過(guò)第1輪structure分析，32份香蕉種質(zhì)被分成4個(gè)群體，各個(gè)群體中是否還存在亞群，需要在各個(gè)群體內(nèi)部再進(jìn)行一次structure分析，如此反復(fù)，直至群體內(nèi)部不存在亞群狀態(tài)，各個(gè)品種被完全分開(kāi)。判斷是否存在亞群的標(biāo)準(zhǔn)為：是否具有顯著差異的△K存在。本研究進(jìn)行了4輪structure分析，最終將這32份種質(zhì)分為4個(gè)種群：Ⅰ：本地大蕉型；Ⅱ：AAA型；Ⅲ：ABB型；Ⅳ：mix型。其中Ⅰ類群包含：尖峰嶺大蕉、興隆山芭蕉、東莞高把大蕉、木棉蕉組成的第一亞群和酸芭蕉和東莞中把大蕉各自獨(dú)立的兩個(gè)亞群。Ⅱ類群：皇帝蕉、Yangambi KM5、Pisang Ceylan和AAcv Rose為一組的第一亞群、FHIA-02、FHIA-18、SH-3640、Grose Michel、華農(nóng)15、Williams為一組的第二亞群，其中華農(nóng)15和Williams經(jīng)過(guò)4輪structure分析依然分不開(kāi)；Ⅲ類群又可以分為三個(gè)亞群：粉蕉組（保亭粉蕉、廣粉、三亞粉蕉、FHIA-01、FHIA-03）；引進(jìn)大蕉組：MCachaco、孟加拉大蕉（MCachaco和孟加拉大蕉在之后的分析中聚在一起）、巨型大蕉、華農(nóng)芭蕉1號(hào)；第三亞群：?？贐B、華農(nóng)芭蕉2號(hào)、金手指。Mix種群中包含：FHIA-21、CRBP-39、Pisang Jari Buaya AA和BITA-3（圖4）。

3 討論與結(jié)論

3.1 structure軟件的聚類分析方法

用于分析群體結(jié)構(gòu)常見(jiàn)的聚類方法主要有兩種。一是基于遺傳距離的方法。計(jì)算一對(duì)距離矩陣，計(jì)算出每對(duì)樣品之間的距離。這種矩陣再運(yùn)用圖示來(lái)表示出來(lái)（例如樹(shù)狀圖或者多維比例圖），最后根據(jù)經(jīng)驗(yàn)將群體進(jìn)行分類。二是基于模型的方法（Structure）。該方法假定每個(gè)類群中的觀測(cè)值是隨機(jī)來(lái)自于一些參數(shù)模型中。然后運(yùn)用一些統(tǒng)計(jì)學(xué)方法（最大似然值或者貝葉斯方法）得到的各個(gè)類群的參數(shù)值來(lái)對(duì)群體進(jìn)行分類?；谶z傳距離方法，其分類結(jié)果太過(guò)于依賴遺傳距離的測(cè)定和研究者對(duì)于圖表的陳述，結(jié)果由于人為干擾因素較大，同時(shí)不能利用到樣品的額外信息，例如：樣品的地理位置信息?；谀Ｐ偷姆椒▋?yōu)點(diǎn)是可以將各樣品的額外信息（地理位置）同遺傳信息結(jié)合來(lái)對(duì)群體分類，同時(shí)分類結(jié)果與遺傳距離相比更加可靠。但structure 2.3版本不適用一些連鎖緊密的標(biāo)記。

本文利用Structure軟件進(jìn)行數(shù)學(xué)模型聚類來(lái)分析，主要依據(jù)運(yùn)行結(jié)果中的似然值[LnP（D）]的變化來(lái)繪制△K的變化圖，選擇出最佳K值（分類群組）。在群組的劃分中，選擇在各品種被分配到同一類群下概率Q值≥0.70的品種劃分到一組。并多次運(yùn)行structure軟件直至群體中無(wú)亞群存在。本研究利用香蕉種質(zhì)資源的SSR基因型數(shù)據(jù)作為structure分析中各樣品的ID信息，以此來(lái)對(duì)32份香蕉種質(zhì)進(jìn)行分類，結(jié)果顯示利用structure軟件能將材料中的亞群分開(kāi)，與使用UPGMA聚類分析相比顯示出獨(dú)特的優(yōu)越性。

3.2 香蕉種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)分析比較

本實(shí)驗(yàn)供試的包括AA、BB、AAA、AAB、ABB、AAAA、AAAB、AABB和ABBB 9種類型的32份香蕉種質(zhì)，structure分類結(jié)果與香蕉在基因型上的劃分基本一致。其中4份香牙蕉（AAA）種質(zhì)在被分到同一類群。3份二倍體（AA）種質(zhì)之間的多樣性差異較大，這與它的多樣性起源有關(guān)系。二倍體（AA）栽培蕉由小果野蕉種內(nèi)雜交或直接突變而來(lái)，因小果野蕉種內(nèi)變異較大，這些遺傳變異豐富的二倍體（AA）種質(zhì)為育種提供基礎(chǔ)。本研究表明AAA群體中的AA型亞群與該群中的其它亞群相聚較遠(yuǎn)，基因型為AAB的Pisang Ceylan被劃分到與基因型為AA的皇帝蕉、AAcv Rose為一組。在B型基因組方面，同為ABB基因型的粉蕉和大蕉被分開(kāi)，同為大蕉的國(guó)內(nèi)大蕉組和引進(jìn)大蕉組并未聚在一起，結(jié)果與王靜毅等[23]一致。基因型為AABB的FHIA-03被劃分到粉蕉組。在已劃分的群組中發(fā)現(xiàn)了很多亞群存在，在國(guó)內(nèi)大蕉組中，酸芭蕉和東莞中把大蕉獨(dú)立成亞群；?？贐B被分到ABB組中，且與華農(nóng)芭蕉2號(hào)、金手指組成單獨(dú)亞群；在引進(jìn)的大蕉組中，MCachaco和孟加拉大蕉單獨(dú)成一亞群，這些結(jié)果在王靜毅等[23]使用UPGMA聚類分析結(jié)果中并未分開(kāi)。Sotto等[25]和Geering等[26]研究發(fā)現(xiàn)野生芭蕉（M. balbisiana）BB基因組中含有較強(qiáng)的病性，本研究對(duì)指導(dǎo)抗病育種有一定的意義。FHIA-02（AAA）和Williams（AAA），F(xiàn)HIA-21（AAAB）和Pisang Jari Buaya（AA）， FHIA-18（AAAB）和SH-3640（AAAB）分別聚在相同的組群，反映了它們之間真實(shí)的遺傳關(guān)系。華農(nóng)15和Williams經(jīng)過(guò)4輪structure分析依然分不開(kāi)（不存在顯著的△K），說(shuō)明它們可能分別是同一克隆。本地大蕉群中的酸芭蕉（ABB）和東莞中把大蕉（ABB）與其它大蕉相聚較遠(yuǎn)；ABB群組中巨型大蕉（ABB）和FHIA-03（AABB）與該群中的其它品種相聚較遠(yuǎn)。

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