林鋒　李國賢　趙妍　汪虹　陳明杰

摘 要 草菇是一種原產(chǎn)于中國熱帶與亞熱帶地區(qū)的栽培食用菌，對草菇主要育種方法，包括人工選擇育種、雜交育種、誘變育種、原生質(zhì)體融合育種、基因工程育種及相關(guān)分子標(biāo)記技術(shù)，如RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）、SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism）、SCAR（Sequence-Characterized Amplified Regions）、草菇交配型基因的分子標(biāo)記、SSR（Simple Sequence Repeat）、SNP（Single Nucleotide Polymorphism）的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并針對當(dāng)前存在的問題與現(xiàn)狀，對草菇育種今后的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞 草菇；育種方法；分子標(biāo)記

中圖分類號 S646.11 文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

草菇[Volvariella volvacea（Bull.ex.Fr.）Sing]又名稻草菇、中國蘑菇，在分類學(xué)上屬真菌門（Eumycetes）、擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）、傘菌目（Agaricales）、光柄菇科（Pluteaceae）、小苞腳菇屬（Volvariella）[1]。草菇原產(chǎn)中國熱帶與亞熱帶地區(qū)，在臺灣、福建、湖南、廣東、廣西等?。ㄗ灾螀^(qū)）栽培廣泛。2008年中國的草菇年產(chǎn)量達(dá)437 200 t[2]，僅廣東省的產(chǎn)值就超過1.5億元[3]。草菇不僅味道鮮美、營養(yǎng)價值豐富，更重要的是作為一種草腐性的食用真菌，能夠利用稻草、麥秸、廢棉、蔗渣等農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)出供人們食藥用的子實(shí)體，其栽培下腳料還可以制成有機(jī)肥料，真正實(shí)現(xiàn)了農(nóng)業(yè)固廢循環(huán)的高效利用，因此近年來草菇生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，使其成為一個新的經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)。

盡管草菇在中國已有300多年的栽培歷史，但仍有許多問題阻礙了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，如生物轉(zhuǎn)化率低（只有10%～40%）、常規(guī)冷藏溫度（4 ℃）會引起菌絲體發(fā)生自溶、菌種易變異退化等等，因此草菇栽培品種改良成為學(xué)者們十分關(guān)注的研究課題。由于草菇被認(rèn)為是一種初級同宗結(jié)合的真菌，其菌絲細(xì)胞多核且無鎖狀聯(lián)合，使得育種者無法從生理形態(tài)上區(qū)分同核與異核菌絲或親本與雜交種，導(dǎo)致草菇遺傳育種研究進(jìn)展十分緩慢，只能借助傳統(tǒng)的馴化、組織分離、孢子分離等人工選擇方法育種[4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是草菇基因組測序的完成，各種分子標(biāo)記逐步被應(yīng)用到草菇育種工作中，并獲得了一系列高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的新菌株。

1 草菇常用育種技術(shù)

1.1 人工選擇育種

人工馴化、組織分離以及孢子分離是人工選擇育種的基本方法，雖然操作簡單，卻是各種育種方法的基礎(chǔ)，并在草菇育種初期獲得了一些優(yōu)良菌株。如李育岳等[5]通過對草菇低溫菌株的馴化篩選，獲得了菌絲生長與出菇溫度均低于原菌株且產(chǎn)量較高、適宜北方栽培的草菇新菌株。組織分離在草菇菌株選育中應(yīng)用非常廣泛，草菇V23、V5菌株便是通過子實(shí)體組織分離的方法得到的[3]。孢子分離法主要是利用食用菌成熟的有性孢子萌發(fā)成菌絲來獲得菌種，其又分為多孢分離與單孢分離兩種[6]。多孢分離[7-8]指將許多擔(dān)孢子一起接入同一個培養(yǎng)基中，讓多個擔(dān)孢子自由萌發(fā)結(jié)合而得到純菌種；單孢分離[7]則每次只取1個擔(dān)孢子，讓其萌發(fā)得到菌絲體進(jìn)而獲得菌種的方法。鄒伯瓊、曹裕漢研究發(fā)現(xiàn)利用草菇單孢分離得到的菌株，其生長速率普遍快于常規(guī)菌株，同時發(fā)現(xiàn)草菇孢子分離菌株在菌絲形態(tài)、生長速率、產(chǎn)厚垣孢子的能力以及產(chǎn)量等性狀上存在較大差異[9-10]。而全面系統(tǒng)地對我國草菇野生資源、栽培品種進(jìn)行調(diào)查、采集、分離、保藏與種性（包括形態(tài)特征、生理習(xí)性、營養(yǎng)價值、遺傳特性）研究，能夠使人工選擇育種產(chǎn)生更有益的效果。

1.2 雜交育種

雜交育種[7，11]是指通過雜交使親本的染色體片段交換或者重組而獲得新的性狀，并在雜交后代中篩選出優(yōu)良新菌株的方法。該方法的方向性與目的性較為明確，主要著眼于雙親性狀間的優(yōu)勢互補(bǔ)或借助其中一個親本的優(yōu)點(diǎn)來克服另一親本的缺點(diǎn)，是遺傳物質(zhì)在細(xì)胞水平上重組的一種育種方法。雜交育種的關(guān)鍵在于雜交種真實(shí)性的鑒定，常規(guī)的判斷方法如菌絲體是否雙核、是否出現(xiàn)鎖狀聯(lián)合等，這些形態(tài)學(xué)上的鑒定方法在草菇雜交育種中并不適用，主要是由于草菇的菌絲體為多核、無鎖狀聯(lián)合且菌落形態(tài)多變。研究者也曾試圖利用生化標(biāo)記來鑒定雜交種，如營養(yǎng)缺陷型與同工酶等，但生化標(biāo)記存在獲得較難或受環(huán)境因素影響較大等缺陷。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)在食用菌領(lǐng)域內(nèi)的不斷應(yīng)用與發(fā)展，新型的分子標(biāo)記為草菇雜交種的鑒定提供了相對較好的途徑，使得雜交育種技術(shù)成為草菇新菌株選育的一種重要育種手段。

與其它食用菌雜交育種一樣，草菇的雜交育種主要指種內(nèi)不同菌株間進(jìn)行雜交。福建農(nóng)林大學(xué)謝寶貴等[12]經(jīng)過三年多的草菇雜交育種試驗(yàn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室小范圍栽培試驗(yàn)與品比試驗(yàn)，均發(fā)現(xiàn)雜交菌株“農(nóng)大1號”的產(chǎn)量顯著高于福建省內(nèi)廣泛栽培的V387，屬較耐高溫的中粒型草菇新菌株。傅俊生等[4]將2個匍匐型不孕的草菇單孢菌株單26、單28進(jìn)行雜交配對，尖端菌絲細(xì)胞分離純化后獲得一氣生型菌株2628，菌種鑒定與品比試驗(yàn)的結(jié)果表明，菌株2628是一個具有優(yōu)良性狀的雜交新菌株。趙光輝[13]選用草菇菌株V0045分別與V0062、V0073、V0032、V0053（屏優(yōu)）進(jìn)行雜交，通過菌株出菇試驗(yàn)，收集農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)，最終獲得了6個草菇優(yōu)勢雜交菌株。

1.3 誘變育種

誘變育種[7，14]是指在育種工作中采用誘變劑引起菌種的遺傳性狀發(fā)生變異，從中挑選出具有優(yōu)良性狀新菌株的方法。根據(jù)誘變劑種類的不同，主要分為物理誘變與化學(xué)誘變兩種方法。物理誘變劑包括非電離輻射類的紫外線、激光與電離輻射類的 χ-射線、γ-射線、快中子等；化學(xué)誘變劑主要是烷化劑與堿基類似物，此外還有亞硝酸、吖啶橙、部分金屬化合物等。由于誘變育種具有變異效率高、處理方法簡單等優(yōu)點(diǎn)，使其成為菌種選育的一個重要途徑。該方法中出發(fā)菌株的選擇、出發(fā)菌株的狀態(tài)以及誘變劑的種類、劑量和處理時間都對誘變效果產(chǎn)生較大的影響。通常選擇生產(chǎn)上性狀穩(wěn)定、優(yōu)良性狀較多的菌株作為出發(fā)菌株，并通過一系列的預(yù)試驗(yàn)來確定誘變劑的最佳劑量與處理時間。草菇育種中借助誘變育種技術(shù)獲得的新菌株也越來越多。王波等[15]選用草菇V4菌株作為出發(fā)菌株，開展了其原生質(zhì)體紫外線誘變育種，通過菌絲生長速度、形態(tài)特征、營養(yǎng)成分以及產(chǎn)量等方面的比較分析，最終獲得了產(chǎn)量較V4菌株高29.1%的優(yōu)良誘變新菌株Vp53。林瑞蝦[16]以草菇菌株屏優(yōu)一號（PY）、屏優(yōu)一號的2個單孢菌株P(guān)Yd15、PYd21及雜交菌株P(guān)Yd15×PYd21為試驗(yàn)材料，采用60Co-γ射線進(jìn)行誘變，以產(chǎn)量高于出發(fā)菌株、子實(shí)體大小優(yōu)于出發(fā)菌株作為篩選條件，最終獲得了14株誘變新菌株，其優(yōu)良性狀的遺傳穩(wěn)定性，將在中試試驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。韓業(yè)君等[17]以草菇主栽品種V23菌株作為出發(fā)菌株，采用紫外線（UV）、60Co-γ射線、硫酸二乙酯（DES）對其原生質(zhì)體進(jìn)行復(fù)合誘變，經(jīng)初篩、復(fù)篩后獲得耐常規(guī)低溫（4 ℃）10 d的菌株VH；栽培實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VH在26 ℃下的生物轉(zhuǎn)化率顯著高于V23，且味道鮮美，是具有應(yīng)用價值的優(yōu)良草菇新菌株。

1.4 原生質(zhì)體融合育種

原生質(zhì)體融合[7，18]是指將去除細(xì)胞壁后不同遺傳類型的原生質(zhì)體，在融合劑（或電場）的誘導(dǎo)下進(jìn)行融合，實(shí)現(xiàn)部分或整套基因組的交換與重組，并產(chǎn)生新品種的過程。由于該方法無需通過食用菌的有性生活史便能獲得遺傳重組，因此與常規(guī)雜交育種相比，原生質(zhì)體融合育種受親緣關(guān)系的影響較小，為遺傳差距較大的遠(yuǎn)緣雜交提供了可能性。與此同時原生質(zhì)體融合育種中，融合子的鑒定是限制該技術(shù)發(fā)展的一個難題，雖然有鎖狀聯(lián)合、同工酶分析、生長拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)及擔(dān)孢子分析等鑒定方法，但均存在一定的問題，仍需找到更可靠的鑒定融合子的方法[19]。在進(jìn)行草菇原生質(zhì)體融合育種之前，首先需要探索其原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件。韓業(yè)君等[20]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶壁酶濃度2%、溫度32 ℃、pH自然、以0.8 mol/L甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑時，選用菌齡3 d的菌絲酶解2 h，可達(dá)到草菇原生質(zhì)體再生的最佳效果。溫海祥等[21]在草菇種內(nèi)進(jìn)行了原生質(zhì)體融合育種的研究，利用草菇不同品種間胞外蛋白酶與淀粉酶活性的差異，對原生質(zhì)體融合后的再生菌株進(jìn)行了檢測，最終篩選到3個與出發(fā)菌株存在顯著差異的融合子。但在草菇種間進(jìn)行原生質(zhì)體融合時，Zhao等[22]采用AP-PCR鑒定融合子時并未發(fā)現(xiàn)雙倍體現(xiàn)象，表明草菇種間的原生質(zhì)體融合較種內(nèi)而言存在一定的難度。

1.5 基因工程育種

基因工程育種[7，14]是一種在基因水平上的遺傳操作，它采用人為手段從供體生物中提取出所需的目的基因，在離體條件下經(jīng)適當(dāng)酶切割或修飾后，將其與載體DNA分子連接一并導(dǎo)入受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)，最終培育出新品種的方法。與常規(guī)育種相比，基因工程育種則是以分子生物學(xué)理論基礎(chǔ)為指導(dǎo)，定向設(shè)計(jì)基因藍(lán)圖并能夠?qū)崿F(xiàn)超遠(yuǎn)緣雜交的一種育種新技術(shù)，該方法可為受常規(guī)育種手段制約的食用菌種類的育種帶來新的解決途徑。目的基因的獲取是基因工程育種的前提與基礎(chǔ)。目前草菇中有很多基因已被克隆，如內(nèi)切葡聚糖酶基因eg1[23]、漆酶基因lac1、lac4[24-25]、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因[26]等，而草菇全基因組測序的完成與草菇全基因組框架圖的構(gòu)建[27]大大縮短了目的基因的獲取時間，為草菇基因工程育種的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。遺傳轉(zhuǎn)化與表達(dá)系統(tǒng)的建立是基因工程育種的重要環(huán)節(jié)。目前食用菌上常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法有PEG法、電激法、基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、限制酶介導(dǎo)法等。郭麗瓊等[28]利用基因槍法，將從瑞典北極云杉卷葉蛾幼蟲中擴(kuò)增出的抗冷凍蛋白基因afp遺傳轉(zhuǎn)化到草菇中，低溫脅迫研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因草菇及其后代均具有較強(qiáng)的耐低溫能力。隨后王藝紅等[29]采用PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體法，將表達(dá)載體pgVvs-mfc與pvg-afp共同轉(zhuǎn)化到草菇菌絲原生質(zhì)體中，羧甲基纖維素鈉酶活和濾紙酶活的試驗(yàn)結(jié)果均表明，整合到草菇基因組中的外源多功能纖維素酶基因mfc提高了草菇的纖維素酶活性，最終使得4個轉(zhuǎn)基因草菇菌株的生物轉(zhuǎn)化率都顯著高于對照組。王春暉等[30]則以PEG400、CaCl2為誘導(dǎo)劑，將平菇“湘平992”的DNA導(dǎo)入到了草菇“瀏陽麻菇”的原生質(zhì)體中，選育出了在溫型、菇型、酶活力以及生物轉(zhuǎn)化率上較親本有著顯著優(yōu)勢的新菌株。

1.6 草菇常用育種技術(shù)比較

草菇菌種選育，即選擇培育出符合生產(chǎn)實(shí)踐需要的優(yōu)良新菌株，取代原有菌株，以提高產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性等。通過比較草菇常用育種技術(shù)（表1），可以發(fā)現(xiàn)雜交育種技術(shù)雖然育種周期較長，但該方法建立在已知性狀的親本間進(jìn)行雜交，育種的方向性、預(yù)見性較好，培育獲得新菌株的有效性較強(qiáng)，為草菇的定向育種提供了一定的保證[31]。人工選擇育種方法在草菇育種中仍會發(fā)揮重要作用，該方法能夠從自然界中引入新的優(yōu)質(zhì)草菇種質(zhì)資源。誘變育種與原生質(zhì)體融合育種由于自身獨(dú)特的優(yōu)勢，如誘變育種具有變異效率較高的特點(diǎn)，原生質(zhì)體融合育種則可不經(jīng)過食用菌有性過程而實(shí)現(xiàn)部分或整套基因組的交換與重組等，使二者成為草菇菌種培育的重要途徑。基因工程育種的目標(biāo)性更強(qiáng)，作為一種新型的草菇育種手段，仍需要大量的研究進(jìn)行不斷地完善，隨著食用菌基因工程技術(shù)的日趨成熟，相信其能夠更好地促進(jìn)草菇育種工作的開展。

2 草菇育種相關(guān)分子標(biāo)記技術(shù)

從本質(zhì)上來講，分子標(biāo)記技術(shù)是通過檢測生物個體在基因或基因型上的變異來反映生物個體間的差異[32]。分子標(biāo)記技術(shù)在食用菌遺傳育種中應(yīng)用廣泛，如種質(zhì)資源評估與菌種鑒定、遺傳多樣性與親緣關(guān)系分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建與基因定位、分子標(biāo)記輔助選擇等方面[33-34]。隨著各種分子標(biāo)記的不斷出現(xiàn)與應(yīng)用，使分子標(biāo)記輔助育種成為食用菌育種的一個重要技術(shù)支撐[35]。由于食用菌的多數(shù)農(nóng)藝性狀與商品性狀在栽培出菇后才能表現(xiàn)出來，因此常規(guī)育種方法不僅費(fèi)時費(fèi)力，同時還需要研究人員具備豐富的育種與栽培經(jīng)驗(yàn)。而利用分子標(biāo)記技術(shù)能夠篩選到與優(yōu)良性狀相關(guān)的標(biāo)記，可有效縮短育種周期，提高育種效率，分子標(biāo)記技術(shù)在草菇遺傳育種中的應(yīng)用越來越多。

2.1 RFLP和RAPD標(biāo)記

RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）標(biāo)記，也被稱為第一代DNA分子標(biāo)記，出現(xiàn)時間最早，是由Bostein D首先提出的基于Southern雜交技術(shù)的一種分子標(biāo)記。該技術(shù)使用某一種限制性內(nèi)切酶切割來自不同個體的基因組DNA或者某一個基因，得到不同長度與數(shù)目的酶切片段。由于特異的DNA/限制性內(nèi)切酶組合所產(chǎn)生的片段是特異的，它可以作為某一DNA的特有“指紋”，直接反映生物的遺傳多態(tài)性。余志晟等[36]在對12個草菇栽培菌株DNA多態(tài)性分析的研究中，應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)，擴(kuò)增了rDNA5.8s+ITS區(qū)段及mtDNA小區(qū)段，并進(jìn)行限制性酶切分析，結(jié)果表明草菇菌株間的rDNA在5.8s+ITS區(qū)段的遺傳差異小，據(jù)此只能將所測試的12個草菇菌株分為2類；而在mtDNA小區(qū)段的檢測中沒能顯示出差異，表明該區(qū)段上所測試草菇菌株遺傳相似性很高。

RAPD（Random Amplified Polymolphic DNA）即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，由美國人Williams等于1990首次提出。該技術(shù)以基因組DNA為模板，以單個人工合成的隨機(jī)多態(tài)核苷酸序列（通常為10個堿基對）為引物，在熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（Taq酶）作用下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖或聚丙烯酰胺電泳分離、溴化乙錠染色后，在紫外透視儀上檢測多態(tài)性，擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性反映了基因組的多態(tài)性。鄧旺秋等[37]對廣東省主要栽培的8個草菇菌株進(jìn)行了RAPD多態(tài)性分析，獲得了這8種草菇菌株的DNA指紋圖譜，構(gòu)建得到的聚類圖表明：RAPD標(biāo)記對草菇菌株的分類與草菇形態(tài)學(xué)上的分類結(jié)果基本一致，說明RAPD標(biāo)記能夠分辨出草菇不同菌株并可快速有效地鑒定草菇商業(yè)菌株。余志晟等[36]在對草菇栽培菌株的RAPD分析中指出，RAPD標(biāo)記技術(shù)結(jié)合聚類分析可以為草菇育種工作提供科學(xué)依據(jù)，研究結(jié)果還表明所測試的草菇菌株遺傳相似度較高，并建議為了更好地促進(jìn)草菇育種，需要尋找新的草菇種質(zhì)資源。徐學(xué)鋒等[38]選用20條隨機(jī)引物分別對14個草菇菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，研究結(jié)果表明：RAPD方法對探索草菇有性世代間的遺傳分離規(guī)律有著重要價值。陳劍等[39]也利用RAPD技術(shù)對草菇雜交后代進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)不同引物的鑒定效果有差異，同時也證明RAPD技術(shù)可以用于鑒定草菇雜交后代。RAPD技術(shù)不僅在草菇育種中起重要作用，在其它食用菌育種中也應(yīng)用廣泛。上官舟建等[40]利用RAPD技術(shù)分析了3株新選育的真姬菇菌株，從分子水平上驗(yàn)證了新菌株遺傳基因間的差異。尚曉冬等[41]從國內(nèi)外收集了19株杏鮑菇菌株并進(jìn)行了RAPD指紋圖譜分析。此外RAPD標(biāo)記在平菇[42]、杏鮑菇[43]、鳳尾菇[44]以及雙孢蘑菇[45]等食用菌中也有相關(guān)研究報(bào)道。

2.2 SRAP和SCAR標(biāo)記

SRAP（Sequence-Related Amplified Polymorphism）即序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性，是一種基于PCR的新型標(biāo)記。該標(biāo)記的基本原理：利用基因外顯子內(nèi)G、C含量豐富，而啟動子與內(nèi)含子里A、T含量豐富的特點(diǎn)設(shè)計(jì)一對引物，對開放閱讀框架進(jìn)行擴(kuò)增[46]。SRAP標(biāo)記以其穩(wěn)定、簡便、產(chǎn)率高、便于目標(biāo)片段克隆等優(yōu)點(diǎn)，自創(chuàng)建以來已被廣泛應(yīng)用于圖譜構(gòu)建[47]與遺傳多樣性分析[48-50]。傅俊生等[4]將SRAP與RAPD技術(shù)相結(jié)合成功鑒定了草菇雜交種2628，在該雜交菌株中共發(fā)現(xiàn)4個SRAP特異遺傳標(biāo)記，其中1個來自于親本單孢26，另外3個來自于親本單孢28。SRAP標(biāo)記除用于草菇育種外，還被用于鳳尾菇菌株的鑒定[44]。

SCAR（Sequence-Characterized Amplified Regions）于1993年由Paran與Michelmore首次提出，該標(biāo)記技術(shù)是在RAPD基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。SCAR的基本步驟：首先需要進(jìn)行RAPD分析，把目的RAPD片段進(jìn)行克隆、測序，然后根據(jù)測序結(jié)果即原RAPD片段兩末端序列設(shè)計(jì)的特定引物，最后用此引物對基因組DNA再次進(jìn)行擴(kuò)增與分析。與RAPD及其它利用隨機(jī)引物的標(biāo)記技術(shù)相比，SCAR具有更好的重復(fù)性，并且可通過擴(kuò)增帶的有無來判斷待測樣品間的差異，該分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳多樣性、品種鑒定、性別鑒定等方面應(yīng)用廣泛[51-54]。在草菇雜交育種鑒定中，傅俊生等[55]先借助SRAP技術(shù)篩選出草菇親本單26與親本單28的4條遺傳差異條帶，并將其成功轉(zhuǎn)化為SCAR遺傳標(biāo)記，應(yīng)用這4個SCAR標(biāo)記成功鑒定了草菇菌株2628的雜種性。在真姬菇雜交育種研究中，Lee等[56]對9個真姬菇菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析后獲得了10個特異性片段，進(jìn)而設(shè)計(jì)了10條引物，最終試驗(yàn)結(jié)果表明使用其中的4條引物便能夠成功地鑒定出雜交菌株，說明SCAR標(biāo)記在真姬菇雜交種鑒定中方法可行。

2.3 草菇交配型基因分子標(biāo)記

汪虹等[57]以草菇交配型基因?yàn)榉肿訕?biāo)記，發(fā)明了一種快速篩選草菇雜交菌株的方法，該方法包括：（1）比較草菇單孢分離菌株交配型A位點(diǎn)的基因序列，根據(jù)基因序列的保守性，對不同草菇單孢分離菌株設(shè)計(jì)并合成特異性引物；（2）將草菇單孢分離菌株用PDA培養(yǎng)獲得菌絲體，使用定制的試劑盒檢測草菇菌株的交配型基因類型；（3）將已確定交配型基因類型的菌株兩兩接種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落相交時，分別從兩個菌落的外側(cè)挑取菌塊轉(zhuǎn)移至試管培養(yǎng)基上進(jìn)行3次繼代培養(yǎng)；（4）使用預(yù)先設(shè)計(jì)的交配型特異性引物，對草菇雜交后的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，研究表明雜交菌株能擴(kuò)增出針對兩個母本交配型的2個條帶，而單孢菌株只能擴(kuò)增出1個條帶。與常規(guī)的形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)等方法相比，該方法具有操作簡便、檢測時間短、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，在草菇雜交育種研究中具有良好的應(yīng)用前景，能夠推動草菇雜交育種工作更好地向前發(fā)展。

2.4 SSR和SNP標(biāo)記

SSR（Simple Sequence Repeat）也稱為微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）、短串聯(lián)重復(fù)（tendom-repeats）、簡單序列長度多態(tài)性（simple sequence length polymorphism）等，通常是以2～3個（少數(shù)為1～6個）核苷酸為單位的多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列。一般每個SSR兩端的序列是相對保守的單拷貝序列，通過這段序列可以設(shè)計(jì)一段互補(bǔ)的寡聚核苷酸引物，對SSR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由于SSR多態(tài)性多由簡單序列重復(fù)次數(shù)的差異引起，通常表現(xiàn)為共顯性[58]。SSR擴(kuò)增產(chǎn)物通常采用高濃度的瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。該標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳圖譜構(gòu)建上已有應(yīng)用[59]，在食用菌中也有相關(guān)的研究應(yīng)用。Zhang等[60-61]將SSR技術(shù)成功地應(yīng)用于金針菇與黑木耳的菌株鑒定工作中，分別建立起10個金針菇的SSR標(biāo)記與17個黑木耳的SSR標(biāo)記。許占伍等[62]研究特異SSR標(biāo)記H35在真姬菇中的可傳遞性，他們以SIEF3133菌株的原生質(zhì)體單核體、孢子單核體及與SIEF3136菌株孢子單核體的雜交菌株為試驗(yàn)材料，結(jié)果表明SSR標(biāo)記H35與交配型因子A2間具有連鎖性，并能跟蹤含有A2交配型單核體的雜交菌株。

SNP（Single Nucleotide Polymorphism）即單核苷酸多態(tài)性，指由于單個核苷酸的變異而導(dǎo)致基因組水平上DNA序列的多態(tài)性，主要有單堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換及顛換等。作為第三代分子標(biāo)記技術(shù)，SNP具有遺傳穩(wěn)定性高、位點(diǎn)豐富且分布廣泛、富有代表性、二態(tài)性與等位基因性、易實(shí)現(xiàn)自動化分析等特點(diǎn)，使其在動植物遺傳育種中發(fā)揮著越來越重要的作用[63-65]，但目前其在真菌尤其在食用菌遺傳育種上應(yīng)用相對較少，可能在未來有著廣闊的應(yīng)用前景。

3 展望

草菇作為一種營養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價值較高的食用菌，其商業(yè)化種植越來越廣泛。作為高溫出菇的草菇，存在低溫貯藏時受冷害嚴(yán)重[66]、采后易開傘導(dǎo)致品質(zhì)下降、生物轉(zhuǎn)化率低等缺點(diǎn)，為了更好地促進(jìn)草菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，選育出優(yōu)質(zhì)的草菇新菌種迫在眉睫?？v觀草菇常用的育種方法，筆者認(rèn)為雜交育種雖然育種周期較長，但是其育種目標(biāo)的預(yù)見性與方向性較好，在較長的一段時間里可能仍是草菇育種的主要手段，當(dāng)然草菇育種想要更好地發(fā)展也離不開其它育種方法的同步進(jìn)行。值得一提的是，基因工程育種技術(shù)能夠通過導(dǎo)入優(yōu)良基因，選育出符合生產(chǎn)上需要的草菇新菌株，使其可能成為今后草菇育種工作中的研究熱點(diǎn)。由于草菇菌絲多核且無鎖狀聯(lián)合，這在很大程度上制約了草菇新菌株的鑒定，分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用為草菇新菌株的選育提供了一條有效的途徑。隨著草菇全基因組測序的完成與框架圖的構(gòu)建[27]，各種分子標(biāo)記（如草菇交配型基因）將會更好地為草菇遺傳育種工作服務(wù)。新興的分子標(biāo)記技術(shù)，如SSR與SNP，雖然在草菇育種中尚未有相關(guān)研究報(bào)道，但是其在動植物和部分食用菌上已有一定的研究進(jìn)展，相信隨著科學(xué)研究的不斷深入，這些高通量的分子標(biāo)記技術(shù)將被廣泛用于草菇種質(zhì)遺傳多樣性分析、雜交子或融合子鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建與基因定位等方面，最終會給草菇遺傳育種工作帶來巨大進(jìn)步。

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