曹紅星　黃漢駒　雷新濤　張大鵬　張如蓮　孫程旭

摘 要 以2年生的油棕幼苗為材料，根據(jù)溫度的日變化規(guī)律，設(shè)置4個(gè)不同的最低溫度處理，分別為CK（自然溫度處理），16 ℃（T1處理）、12 ℃（T2處理）、8 ℃（T3處理），處理20 d后對(duì)其在不同低溫處理下葉片的傷害情況、解剖結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了分析研究。結(jié)果表明：隨著處理溫度的降低，葉片受傷害情況越來(lái)越嚴(yán)重。其中油棕葉片總厚度和組織疏松度（SR）2個(gè)葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)在不同低溫處理下變化明顯，可作為油棕抗寒種質(zhì)鑒定的結(jié)構(gòu)指標(biāo)，為培育適合在中國(guó)栽培的抗寒油棕品種提供理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 油棕；低溫處理；解剖結(jié)構(gòu)

中圖分類(lèi)號(hào) Q945.78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

油棕（Elaeis guineensis Jacq）是世界上產(chǎn)油效率最高的植物，所生產(chǎn)的油脂比同面積的花生高出5倍，比大豆高出9倍。油棕作為食用油和生物柴油的優(yōu)質(zhì)原料，不但單產(chǎn)高、生態(tài)效益好、實(shí)際生產(chǎn)成本較低，而且不與糧食形成競(jìng)爭(zhēng)，在熱帶地區(qū)頗受青睞[1]。油棕是典型的熱帶作物，喜高溫多濕的氣候，日均溫在18 ℃以上才能開(kāi)始生長(zhǎng)發(fā)育，最適宜的氣溫是24～27 ℃[2]。在中國(guó)的海南、兩廣南部、臺(tái)灣南部、云南西雙版納等部分地區(qū)均有引種和種植[3-4]。中國(guó)地處熱帶北緣，油棕種植的溫度條件與油棕原產(chǎn)區(qū)差距較大，低溫成為限制油棕產(chǎn)量和擴(kuò)大其種植面積的重要因子。培育和篩選抗寒性較強(qiáng)的品種是中國(guó)油棕育種的重要目標(biāo)，開(kāi)展油棕抗寒性鑒定研究，篩選抗寒種質(zhì)，對(duì)油棕產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要[5]。

Rabiah等[6]報(bào)道了油棕在開(kāi)花過(guò)程中分生組織解剖結(jié)構(gòu)的變化；Luis等[7]通過(guò)研究油棕試管苗和大棚培育的種子幼苗在葉片解剖結(jié)構(gòu)上的差異，包括氣孔的大小和密度、表皮蠟質(zhì)含量、葉肉厚度、細(xì)胞間隙的大小等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)2種幼苗葉片解剖結(jié)構(gòu)的基本組成相似，試管苗的表皮細(xì)胞較薄，葉片的中脈由3～4條維管束組成，而大棚培育的種子幼苗葉片較厚，葉片的中脈較粗，中央有1條維管束，為評(píng)價(jià)2種幼苗對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性奠定基礎(chǔ)。Abe等[8]研究了不同資源類(lèi)型的油棕在維管束結(jié)構(gòu)方面的差異。然而關(guān)于低溫對(duì)油棕解剖結(jié)構(gòu)變化的影響及利用葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)對(duì)油棕資源的抗寒性評(píng)價(jià)研究鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)油棕在低溫處理下葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)的變化情況研究，篩選出與抗寒相關(guān)的結(jié)構(gòu)指標(biāo)，為創(chuàng)新利用抗寒油棕種質(zhì)資源提供生產(chǎn)直觀、易操作的評(píng)價(jià)指標(biāo)，同時(shí)為抗寒種質(zhì)資源的早期準(zhǔn)確篩選鑒定及縮短其利用周期奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試油棕取自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所（海南省文昌市）育苗基地，選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)病害的2年生盆栽苗。

1.2 低溫脅迫處理

實(shí)驗(yàn)于2013年1月6日至26日進(jìn)行。選取生長(zhǎng)一致的盆栽苗于植物光照培養(yǎng)箱中（型號(hào)： RXZ-280B）進(jìn)行低溫脅迫，以自然條件下盆栽處理為對(duì)照（CK），根據(jù)自然條件下溫度的日變化進(jìn)行模擬，設(shè)置不同的最低溫度處理：T1（16 ℃），T2（12 ℃），T3（8 ℃）（表1）。各處理結(jié)束后，以頂端下第3片葉做為樣品葉進(jìn)行石蠟切片，同時(shí)觀察植株出現(xiàn)的寒害癥狀，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每重復(fù)3株苗。

1.3 葉片解剖結(jié)構(gòu)的測(cè)定

取頂端以下第3片葉，從葉片中部切取5 mm×3 mm的小片，依次經(jīng)過(guò)卡諾固定液固定、酒精梯度脫水法脫水、透明、浸蠟、包埋、Leica RM2235型石蠟切片機(jī)切片（厚度8～10 μm）、番紅染色、中性樹(shù)膠封片，最后于Leica DM2500顯微鏡下觀察拍照，同時(shí)測(cè)量葉片厚度、上表皮厚度、上角質(zhì)層厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、下表皮厚度、下角質(zhì)層厚度，并計(jì)算組織緊密度（CTR）、組織疏松度（SR）及（P/I）。每個(gè)溫度處理觀察3個(gè)切片，每個(gè)切片取10個(gè)視野測(cè)定平均值[9-11]。

組織緊密度（CTR）/%=柵欄組織厚度/葉片總厚度×100

組織疏松度（SR）/%=海綿組織厚度/葉片總厚度×100

（P/I）=柵欄組織厚度/海綿組織厚度

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，然后采用SPSS軟件，對(duì)測(cè)定的解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和Duncan多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下植株的寒害表現(xiàn)

通過(guò)對(duì)2年生油棕在不同低溫脅迫下植株的寒害情況進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)（表2），在自然溫度（CK）處理?xiàng)l件下，油棕幼苗生長(zhǎng)正常，植株葉形、葉色未見(jiàn)明顯變化，無(wú)萎蔫脫水的現(xiàn)象；在T1（最低溫度16 ℃）處理第8天時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)葉片萎焉的現(xiàn)象，第16天葉片縮緊，第17天葉片輕度折疊，第20天葉片有點(diǎn)變干；在T2（最低溫度12 ℃）處理時(shí)，也是第8天開(kāi)始出現(xiàn)葉片萎焉的現(xiàn)象，但第11天葉片縮緊，第17天葉片變干，第19天表現(xiàn)為少許葉片變褐，第20天和第19天的變化差異不大；而在T3（最低溫度8 ℃）處理時(shí)，第6天葉片就開(kāi)始出現(xiàn)萎焉的現(xiàn)象，第10天葉片縮緊，第16天時(shí)發(fā)現(xiàn)葉片收緊，部分葉片失水變褐，第20天葉片全部變成褐色，嚴(yán)重失水。由此可知，隨著溫度的降低，植株寒害程度不斷加劇，出現(xiàn)萎蔫和葉片緊縮的時(shí)間越來(lái)越早，失水現(xiàn)象越嚴(yán)重。

2.2 低溫脅迫下葉片的解剖結(jié)構(gòu)比較

對(duì)不同低溫處理下油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)變化的研究發(fā)現(xiàn)（圖1），氣孔多分布于下表皮，自然處理?xiàng)l件下柵欄組織排列緊密，但隨著處理溫度的下降，細(xì)胞失水程度不斷增大，細(xì)胞間隙越來(lái)越大，柵欄組織單個(gè)細(xì)胞長(zhǎng)度越變?cè)酱螅帕性絹?lái)越不規(guī)則，柵欄組織的厚度變??；自然條件下海綿組織邊緣規(guī)則，隨著溫度的下降，胞間隙擴(kuò)大，邊緣越來(lái)越不規(guī)則，尤其在T3處理下，柵欄組織和海綿組織幾乎不能區(qū)別，細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形。

2.3 低溫脅迫下葉片組織解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較分析

2.3.1 葉片總厚度和角質(zhì)層厚度 由表3可知，隨著處理溫度的降低，油棕總?cè)~片厚度逐漸減小，CK的葉片總厚度和T1、T2、T3處理都存在顯著水平的差異，并且T2、T3處理之間還達(dá)到極顯著差異水平。T1、T2、T3處理的葉片總厚度與CK相比，分別減少了9.75%、18.15%、36.57%，表明T1處理的低溫即對(duì)葉片產(chǎn)生脅迫，在T2、T3處理下葉片受到的脅迫傷害加深。

上下角質(zhì)層厚度變化呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。T1處理和CK的上下角質(zhì)層厚度相比分別降低了10.95%、3.23%，但都未達(dá)到顯著差異的水平；T2和T3處理的上下角質(zhì)層厚度與CK的差異均達(dá)到極顯著水平，其上角質(zhì)層厚度分別比CK減少58.10%、47.63%，下角質(zhì)層厚度分別比CK減少48.39%、43.23%。但在T3處理中，其角質(zhì)層厚度反而比T2處理有所增加，可能與該處理下角質(zhì)層結(jié)構(gòu)已變形有關(guān)。

2.3.2 表皮厚度和復(fù)表皮厚度變化 由表3可知，T1處理下上下表皮的厚度都比CK處理的值小，降幅分別達(dá)21.03%、16.79%。但未達(dá)到顯著差異水平。但在T2和T3處理下的表皮厚度反而比T1處理的值高，可能因?yàn)闅饪锥喾植加诒砥?，隨著低溫脅迫的進(jìn)行，氣孔關(guān)閉，使得視野中觀察到的表皮厚度反而增加，推測(cè)油棕表皮厚度對(duì)T2、T3處理反應(yīng)較為敏感。

上下復(fù)表皮厚度均隨著溫度的降低而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，T1、T2和T3處理的上復(fù)表皮厚度分別比CK減少10.94%、22.00%、31.25%，下復(fù)表皮厚度分別比CK減少7.50%、29.17%、46.67%。其中CK處理的下復(fù)表皮厚度與T2、T3處理都達(dá)到極顯著差異水平，但與T1處理間未達(dá)到顯著差異水平。

2.3.3 柵欄組織與海綿組織厚度變化 柵欄組織和海綿組織厚度隨著溫度的降低而降低，與葉片厚度變化趨勢(shì)一致。T1、T2和T3處理下，柵欄組織厚度分別比CK減少4.38%、15.63%、35.63%，海綿組織厚度分別比CK減少9.87%、13.00%、42.60%（表3）。柵欄組織厚度在T3處理下與T1、T2、CK的差異分別達(dá)到極顯著差異水平，而海綿組織厚度的變化也表現(xiàn)出了類(lèi)似情況，可能與該處理下柵欄組織和海綿組織結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞變形有關(guān)。

2.3.4 CTR、SR及（P/I）的變化 根據(jù)表3所示，CTR 值在不同溫度處理下變化幅度較小，僅有CK和T3處理達(dá)到顯著差異的水平，所有處理之間都未達(dá)到極顯著差異的水平。SR值在不同處理之間都達(dá)到顯著差異的水平，T1、T2和T3處理和CK處理都達(dá)到極顯著差異的水平。在不同低溫脅迫下，P/I變化不明顯，都未達(dá)到顯著差異的水平。

3 討論與結(jié)論

低溫是油棕生長(zhǎng)發(fā)育和擴(kuò)大種植面積的重要限制因子之一[12]，葉片是進(jìn)行光合作用和蒸騰作用的主要器官，對(duì)低溫脅迫反應(yīng)敏感，葉片解剖結(jié)構(gòu)的變化是植物對(duì)環(huán)境變化響應(yīng)與適應(yīng)的基礎(chǔ)，因此葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)的變化常被用來(lái)作為植物抗寒鑒定的依據(jù)之一。

本研究發(fā)現(xiàn)葉片厚度、海綿組織厚度、柵欄組織厚度等指標(biāo)均隨著溫度的降低而呈現(xiàn)遞減趨勢(shì)。在低溫處理下，葉片厚度減小[13-14]，可能是隨著處理溫度的降低，造成細(xì)胞脫水，根部吸水能力降低，此時(shí)植株通過(guò)減少葉片厚度來(lái)降低組織含水量，從而增加胞液濃度以提高其抗寒能力，同時(shí)也伴隨出現(xiàn)植株脫水寒害癥狀；角質(zhì)層可防止水分蒸發(fā)，維持正常代謝，保溫、保水，T2處理對(duì)角質(zhì)層厚度的變化有顯著的影響作用，但在T3處理下，葉片萎蔫變干，角質(zhì)層遭到破壞，其變化不規(guī)律；T1處理下表皮厚度減小，但在T2和T3處理下，變化不規(guī)律，可能氣孔分布在表皮上，其開(kāi)關(guān)閉合容易受低溫的影響，導(dǎo)致表皮厚度的變化大；油棕的柵欄組織和海綿組織厚度在不同溫度處理下都表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，尤其是T3處理和其他處理之間都達(dá)到極顯著差異水平，可能與該處理下組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重變形有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究表明，在重度低溫脅迫（如T3處理）下，油棕植株嚴(yán)重脫水死亡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形，與已有的一些研究結(jié)果相類(lèi)似[15-17]。

在利用葉片解剖結(jié)構(gòu)指標(biāo)評(píng)價(jià)植物的抗寒性時(shí)，單一的葉片結(jié)構(gòu)參數(shù)受環(huán)境影響大，不能反映植物的抗寒能力，所以建議采用葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）和疏松度（SR）作為評(píng)價(jià)抗寒能力的指標(biāo)。相關(guān)學(xué)者對(duì)杏[18]，越橘[19]，翅莢木[20]，茶樹(shù)[21]，核桃屬[22]，廣玉蘭[23]，楊樹(shù)[24]等葉片解剖結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，葉片細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)緊密度和疏松度與植物的抗寒性有一定的關(guān)系，CTR 值越大，SR值越小，其抗寒性越強(qiáng)。本研究中，CTR和P/I相對(duì)比較穩(wěn)定，SR的變化相對(duì)較大，不同處理之間都達(dá)到顯著差異水平。但不同低溫處理的CTR均比SR小，說(shuō)明油棕抗寒性較弱。

通過(guò)上述油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)在低溫處理下的變化研究，認(rèn)為油棕葉片總厚度和組織疏松度（SR）2個(gè)葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)在不同低溫處理下變化明顯，可作為油棕抗寒種質(zhì)鑒定的結(jié)構(gòu)指標(biāo)。T2處理（最低溫度12 ℃）和T3處理（最低溫度8 ℃）對(duì)油棕的傷害比較大，不僅使葉片變褐，而且引起其結(jié)構(gòu)紊亂，可在T1處理時(shí)進(jìn)行油棕幼苗低溫鍛煉，以增強(qiáng)其抗寒性。本研究認(rèn)為油棕在T1處理下受到輕度低溫脅迫，在T2處理下受到中度脅迫，T3處理下受到嚴(yán)重脅迫傷害，導(dǎo)致幼苗葉片失綠，逐近變成褐色，甚至停止生長(zhǎng)。

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