韓梅梅　楊曉帆　王軍　潘秋紅

摘 要 利用高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)，分析3個(gè)釀酒葡萄品種（美樂、品麗珠、赤霞珠）不同品系及同一品系（赤霞珠338）不同定植地點(diǎn)葡萄果皮中的花色苷種類與含量。結(jié)果表明：同一品種不同品系之間花色苷種類相似，但花色苷含量有所差異，差異程度取決于葡萄品種；‘美樂348總花色苷含量顯著高于‘美樂181，且其花翠素類花色苷含量明顯高于其他3個(gè)品系，品系間大部分花色苷含量差異顯著；盡管‘品麗珠和‘赤霞珠各品系在花色苷總量和花翠素類花色苷上沒有明顯差異，但這2個(gè)品種的品系之間有少數(shù)基本花色苷含量呈現(xiàn)顯著性差異；同一品系不同定植地點(diǎn)，果實(shí)花色苷總量和組成比例都存在較大差異。結(jié)果說明果實(shí)中各種花色苷組成比例既依賴于品種，也受品系和產(chǎn)地的影響，且產(chǎn)地因素的影響大于品系。

關(guān)鍵詞 花色苷；品系；定植地點(diǎn)；釀酒葡萄

中圖分類號 Q946.83+6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

花色苷是紅色葡萄品種及紅葡萄酒的主要呈色物質(zhì)，其種類與含量決定了葡萄與葡萄酒的呈色[1]。葡萄酒中的花色苷主要來源于葡萄果實(shí)，在葡萄酒陳釀過程中，花色苷還可以與單寧等其它物質(zhì)作用，進(jìn)而影響葡萄酒的色澤與口感[2-3]。此外，花色苷具有抗氧化和清除自由基的生理活性[4-5]，是葡萄酒保健功效的貢獻(xiàn)者之一。因此，葡萄果實(shí)中的花色苷對葡萄酒的顏色、口感、營養(yǎng)價(jià)值等多方面有作用。

葡萄果實(shí)花色苷的生物合成有2個(gè)分支：一個(gè)是類黃酮-3′-羥基化酶（F3′H）介導(dǎo)的花青素類花色苷的合成途徑，另一個(gè)是類黃酮-3′5′-羥基化酶（F3′5′H）介導(dǎo)的花翠素類花色苷的合成途徑[6]（圖1）。這2類花色苷主要差異在于B環(huán)取代基數(shù)目的不同，花青素類是3′和4′取代，而花翠素類為3′、4′和5′取代，其最大吸收波長分別為516～525 nm，二者可分別使葡萄果皮呈現(xiàn)紫紅色和紫羅蘭色/藍(lán)色色調(diào)[7]。B-環(huán)上取代基數(shù)目越多，花色苷越偏向于藍(lán)色色調(diào)[8]。因此，花色苷種類與含量在很大程度上決定了葡萄酒的色澤，進(jìn)而影響葡萄酒的感官質(zhì)量。

歐亞種（Vitis Vinifera L.）釀酒葡萄總花色苷中B-環(huán)3′5′-位取代花色苷所占比例遠(yuǎn)高于B-環(huán)3′-位取代的花色苷，并且主要以甲基形式取代[9]。中國主要紅色釀酒品種有赤霞珠、品麗珠、蛇龍珠及美樂等歐亞種，果實(shí)花色苷種類與含量不僅取決于自身基因型，而且受如溫度、光照、水分和土壤養(yǎng)分等環(huán)境條件強(qiáng)烈影響[10-15]，使得同一品種在不同地區(qū)展現(xiàn)出不同花色苷指紋。關(guān)于葡萄果實(shí)花色苷的研究，以往的報(bào)道主要集中于不同葡萄品種之間的比較，環(huán)境條件及生長調(diào)節(jié)劑對花色苷積累的影響以及花色苷生物合成與調(diào)控[6，13，16-18]，而對同一品種不同品系之間的花色苷關(guān)注較少。

品系是指品種內(nèi)的不同類型，或在育種過程中，表現(xiàn)較好，但還沒有成為品種之前的變異類型[19]。同一葡萄品種不同品系之間花色苷指紋有何差異？品系之間的差異在不同品種之間是否有共性？在不同定植地點(diǎn)同一品系花色苷指紋又有何不同？本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）技術(shù)分析了3個(gè)常見釀酒葡萄品種美樂、品麗珠和赤霞珠的不同品系中花色苷的種類及含量，找出其異同點(diǎn)，為新品系的推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 品系 參試材料為美樂（Vitis vinifera L. Merlot）4個(gè)品系181、343、346和348；品麗珠（Vitis vinifera L. Cabernet Franc）2個(gè)品系327和409；赤霞珠（Vitis vinifera L. Cabernet Sauvignon）3個(gè)品系170、338和685；這些品系均在2006年定植于河北昌黎華夏長城葡萄酒公司華夏母本園，參照上一年葡萄商業(yè)采收期，結(jié)合當(dāng)年的氣候狀態(tài)，分別于2009年9月21日、10月5日和10月14日取樣，為使取樣具有代表性，按Boulton等[20]所述方法摘取百粒果，采后存放于泡沫盒內(nèi)，于當(dāng)天運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 栽培環(huán)境條件 不同定植地點(diǎn)葡萄花色苷差異的研究所用樣品為‘赤霞珠338，取樣地點(diǎn)分別為華夏長城葡萄酒公司位于河北省撫寧縣吳官營村葡萄園的4個(gè)地塊，分別以‘低洼、‘高坡、‘門前、‘屋后代稱。吳官營村北靠森林，東西相接英山河水庫，3面群山環(huán)抱，坡度較高，北坡向陽，日照充足，晝夜溫差大，無霜期195 d左右，年降雨量550 mm；葡萄園為南北行向，行株距為2.5 m×0.6 m。本研究中‘低洼與‘高坡地塊主要是坡度的差異，‘門前地塊為向陽面，光照充足，‘屋后為陰面，其它栽培條件一致，即不同地塊主要是坡向不同，導(dǎo)致葡萄園持水與受光存在較大差異。所有樣品均達(dá)到商業(yè)采收期，且成熟度較一致。采樣方法同上。

1.2 方法

1.2.1 葡萄果皮中花色苷的提取 將葡萄樣品果皮剝離并用液氮研磨，冷凍干燥，干燥后的粉末于-40 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?）稱取葡萄皮干粉0.5 g置于三角瓶中；（2）加入10 mL含2%甲酸甲醇提取液，超聲萃取10 min，于25 ℃下避光以150 r/min震蕩萃取30 min，然后以8 000 ×g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于100 mL圓底燒瓶中，重復(fù)提取5次；（3）合并上清液，經(jīng)30 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲酸和甲醇，用定容劑（流動(dòng)相A ∶ B=9 ∶ 1）重新溶解并定容至10 mL，以0.22 μm水系膜過濾上樣。

1.2.2 HPLC-ESI-MS分析 采用Agilent 1100系列配有二極管陣列檢測器（DAD）的LC/MSD Trap-VL液相色譜-離子阱-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）進(jìn)行樣品分析，MSD包括電噴霧離子源和離子阱質(zhì)譜檢測器，所有部件均由安捷倫v.5.2化學(xué)工作站控制。色譜柱：Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相A ∶ 水 ∶ 甲酸 ∶ 乙腈=92 ∶ 2 ∶ 6（V ∶ V ∶ V），流動(dòng)相B ∶ 水 ∶ 甲酸 ∶ 乙腈=44 ∶ 2 ∶ 54（V ∶ V ∶ V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：50 ℃；進(jìn)樣量：30 μL；檢測波長：525 nm。

1.2.3 花色苷定性定量方法 （1）定性分析：基于本實(shí)驗(yàn)室建立的“葡萄與葡萄酒花色苷 HPLC-UV-MS/MS指紋譜庫”的基礎(chǔ)上，通過對樣品HPLC-UV-MS/MS圖譜中質(zhì)譜信息、光譜信息和保留時(shí)間與譜庫比對分析，確定花色苷組分。

（2）定量分析：以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)物，建立5～500 mg/L之間9個(gè)水平、3個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸系數(shù)在0.999以上，進(jìn)行外標(biāo)法定量，所有花色苷均以相當(dāng)于二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計(jì)。果皮中花色苷含量均用mg/g（每克干果皮中所含花色苷的毫克數(shù)）表示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)葡萄樣品均進(jìn)行3個(gè)獨(dú)立的提取，以獲得3個(gè)重復(fù)，以獨(dú)立方差T檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩差異顯著性分析，使用鄧肯式多重比較進(jìn)行3個(gè)以上樣品差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品系葡萄果皮花色苷總量的比較

從圖2可看出，對于不同葡萄品種，品系間花色苷含量組成不同?！罉?48果皮中總花色苷含量顯著高于‘美樂181，這主要是由于該品系含有很高的花翠素類花色苷。而‘美樂343和‘美樂346與‘美樂348相比，在總花色苷含量上沒有顯著性差異，但花青素類花色苷含量明顯較高。這些結(jié)果說明在‘美樂348果皮花色苷合成途徑中，碳源更多地流向F3′5′H支路而生成花翠素類花色苷；‘美樂181果皮中的花色苷類物質(zhì)含量在4個(gè)品系中最低。

‘品麗珠327和‘品麗珠409果皮中的總花色苷、花翠素類花色苷及花青素類花色苷含量均沒有顯著性差異。對于‘赤霞珠的3個(gè)品系，總花色苷和花翠素類花色苷含量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異，但‘赤霞珠338花青素類花色苷含量高于‘赤霞珠170和‘赤霞珠685。

此外還可以看出，‘品麗珠與‘赤霞珠果皮中各類花色苷的含量比例相似，花青素類花色苷占總花色苷的10%左右。除了‘美樂348中花青素類花色苷占總花色苷的17%以外，美樂其它品系花青素類花色苷所占比例達(dá)到20%以上，且除‘美樂181以外，‘美樂其它品系的花色苷總量高于‘品麗珠與‘赤霞珠。

2.2 不同品系葡萄果皮各種花色苷含量的比較

品系之間花色苷種類差別不大。從表1～3可以看出，除‘赤霞珠338沒有檢測到甲基花翠素-3-O-6-反式香豆?；咸烟擒蘸投谆ù渌?3-O-6-反式香豆?；咸烟擒找酝?，其它所有樣品均檢測到16種花色苷。

在‘美樂4個(gè)品系中，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高，占花色苷總量的20%以上。其次含量較高的依次是甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-6-乙酰化葡萄糖苷及二甲花翠素-3-O-6-反式香豆?；咸烟擒?。在‘美樂348果皮中后兩者含量顯著高于甲基花青素-3-O-葡萄糖苷，并且顯著高于其它3個(gè)品系；‘美樂343和‘美樂346果皮中的甲基花青素-3-O-葡萄糖苷含量顯著高于‘美樂181與‘美樂348。這4種花色苷占 ‘美樂總花色苷含量的一半以上，是‘美樂葡萄的主要花色苷?！罉?48葡萄果皮中的4種主要花色苷含量之和顯著高于另外3個(gè)品系。除了甲基花翠素-3-O-6-順式香豆酰化葡萄糖苷之外，其它15種花色苷的含量在品系之間或多或少都存在差異（表1）。

就‘品麗珠而言，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷占花色苷總量的30%以上，其次是二甲花翠素-3-O-6-乙?；咸烟擒?、二甲花翠素-3-O-6-反式香豆酰化葡萄糖苷及甲基花青素-3-O-葡萄糖苷。‘品麗珠327中除了甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和花翠素-3-O-葡萄糖苷含量顯著高于‘品麗珠409以外，其他花色苷物質(zhì)在2品系之間均沒有顯著性差異。另外，4種主要花色苷占 ‘品麗珠總花色苷含量的70%以上，其含量之和在‘品麗珠327與‘品麗珠409之間也沒有顯著性差異（表2）

與‘美樂和‘品麗珠相似，‘赤霞珠果皮中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量最高，占總花色苷含量的40%以上，其次為二甲花翠素-3-O-6-乙酰化葡萄糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-6-反式香豆酰化葡萄糖苷；除‘赤霞珠338中甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-6-乙?；咸烟擒蘸突ù渌?3-O-6-香豆?；咸烟擒蘸匡@著高于‘赤霞珠170和‘赤霞珠685以外，其它花色苷在‘赤霞珠3個(gè)品系間均無顯著性差異（表3）。

以上結(jié)果表明，‘美樂各品系之間大部分花色苷存在顯著性差異，而‘品麗珠和‘赤霞珠中，各品系之間只有2～4種主要花色苷存在統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性差異，其它大部分花色苷差異不明顯，說明葡萄果實(shí)花色苷含量既依賴于品種也依賴于品系，品系的影響相對要小得多。

2.3 不同定植地點(diǎn)‘赤霞珠338果皮花色苷含量的比較

各地塊種植的‘赤霞珠338在花色苷組成比例上也存在一定差異（圖3），4個(gè)地塊中，‘屋后地塊‘赤霞珠338中的總花色苷含量最高，表現(xiàn)為花翠素類和花青素類花色苷含量均很高，且均顯著高于‘低洼地塊樣品，在總量上與其它2地塊沒有顯著性差異。

所有地塊樣品均檢測到16種花色苷（表4），‘屋后地塊葡萄果皮中，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-6-乙?；咸烟擒铡⒒ù渌?3-O-葡萄糖苷和甲基花青素-3-O-葡萄糖苷等4種花色苷的含量顯著高于‘低洼地塊，這4種花色苷含量占了總量的70%。其它種類的花色苷在不同地塊之間也存在差異。與品系因素的影響相比，葡萄種植環(huán)境對花色苷組成比例的影響相對較大。

3 討論與結(jié)論

本研究表明，葡萄品系之間花色苷含量存在差異，其差異程度取決于葡萄品種。‘品麗珠和‘赤霞珠各品系之間只有少數(shù)基本花色苷存在顯著性差異，而‘美樂各品系之間大部分的花色苷存在明顯差異。這與何建軍[7]研究結(jié)果一致，其報(bào)道指出歐亞種葡萄中‘美樂品種的F3′H途徑較為活躍；而‘美樂品系間花色苷含量的差異主要與類黃酮途徑中碳源更多地流向F3′5′H分支途徑有關(guān)。

不同定植地的土壤及微氣候?qū)せㄉ蘸康挠绊懣赡芨蟆τ谕黄废?，不同地塊生長的果實(shí)中各種花色苷的含量存在較大差異。本研究表明這種差異主要在于整個(gè)類黃酮代謝的強(qiáng)弱，類黃酮代謝中2個(gè)分支路徑的影響程度相似。有研究顯示，灌溉過量會使花色苷濃度降低，而水分缺失則導(dǎo)致花色苷含量升高[13，15，21]；低溫可以促進(jìn)花色苷的合成，光照過強(qiáng)對花色苷有抑制作用[10-11，22-23]。本研究中‘屋后地的果實(shí)，其花色苷合成的2個(gè)分支途徑的產(chǎn)物均顯著高于‘低洼地生長的果實(shí)，這是由于‘屋后地塊溫度較低，‘低洼地塊光照過強(qiáng)且易積累水分等因素造成的。

葡萄果實(shí)中花色苷的合成會受到基因型和環(huán)境因素等多方面的影響[24]。不同品種或品系的葡萄，由于其基因型的差異會影響花色苷物質(zhì)的含量和種類；而不同定植地點(diǎn)的同一葡萄品種或品系，由于光照、溫度、水分條件等差異也會導(dǎo)致花色苷含量有所差異。因此，針對不同的品種、品系特點(diǎn)，合理選擇定植區(qū)域，才能發(fā)揮其優(yōu)勢。

參考文獻(xiàn)

[1] Mazza G， Francis F J. Anthocyanins in grapes and grape products[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 1995， 35（4）： 341-371.

[2] González-Manzano S， Duenas M， Rivas-Gonzalo J C， et al.Studies on the copigmentation between anthocyanins and flavan-3-ols and their influence in the colour expression of red wine[J]. Food Chemistry， 2009， 114（2）： 649-656.

[3] Monagas M， Bartolomé B， Gómez-Cordovés C. Evolution of polyphenols in red wines from Vitis vinifera L. during aging in the bottle[J]. European Food Research and Technology， 2005， 220（3-4）： 331-340.

[4] De Gaulejaca N S-C， Gloriesb Y， Vivas N. Free radical scavenging effect of anthocyanins in red wines[J]. Food Research International， 1999， 32（5）： 327-333.

[5] de Pascual-Teresa S， Sanchez-Ballesta M T. Anthocyanins： from plant to health[J]. Phytochemistry Reviews， 2008， 7（2）： 281-299.

[6] He F， Mu L， Yan G-L， Liang N N， et al. Biosynthesis of anthocyanins and their regulation in colored grapes[J]. Molecules， 2010， 15（12）： 9 057-9 091.

[7] 何建軍. 影響釀酒葡萄果實(shí)中花色苷結(jié)構(gòu)修飾的因素分析[D].北京： 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010.

[8] 李 華， 王 華， 袁春龍，等. 葡萄酒化學(xué)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2005： 108.

[9] 劉闖萍， 王 軍. 葡萄花色苷的生物合成[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2008， 44（2）： 363-377.

[10] Bergqvist J， Dokoozlian N， Ebisuda N. Sunlight exposure and temperature effects on berry growth and composition of Cabernet Sauvignon and Grenache in the central San Joaquin Valley of California[J]. American Journal of Enology and Viticulture， 2001， 52（1）： l-7.

[11] Cohen S D， Tarara J M， Kennedy J A. Assessing the impact of temperature on grape phenolic metabolism[J]. Analytica Chinica Acta， 2008， 621（1）： 57-67.

[12] Kliewer W M. Influence of temperature， solar radiation and nitrogen on coloration and composition of Emperor grapes[J]. American Journal of Enology and Viticulture， 1977， 28（2）： 96-103.

[13] Jackson D I， Lombard P B. Environmental and management practices affecting grape composition and wine quality-A Review[J]. American Journal of Enology and Viticulture， 1993， 44（4）： 409-430.

[14] Reay P F， Fletcher R H， Thomas V J. Chlorophyll， carotenoids and anthocyanin concentrations in the skin of “Gala” apples during maturation and the influence of foliar applications of nitrogen and magnesium[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 1998， 76（1）： 63-71.

[15] Roby G， Harbertson J F， Adams D A， et al. Berry size and vine water deficits as factors in winegrape composition： anthocyanins and tannins[J]. Grape and Wine Research， 2004， 10（2）： 101-107.

[16] Cortell J M， Kennedy J A. Effect of shading on accumulation of flavonoid compounds in（Vitis vinifera L.）Pinot Noir fruit and extraction in a model system[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry， 2006， 54（22）： 8 510-8 520.

[17] Downey M O， Dokoozlian N K， Krstic M P. Cultural practice and environmental impacts on the flavonoid composition of grapes and wine： A Review of Recent Research[J]. American Journal of Enology and Viticulture， 2006， 57（3）： 257-268.

[18] Pomar F， Novo M， Masa A. Varietal differences among the anthocyanin profiles of 50 red table grape cultivars studied by high performance liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A， 2005， 1 094（1-2）： 34-41.

[19] 張振文， 劉延琳， 賀普超， 等. 葡萄品種學(xué)[M]. 陜西： 西安地圖出版社， 2000： 2.

[20] Boulton R B， Singleton V L， Bisson L F， et al. Principles and practices of winemaking： Selection of state of ripeness for harvest and harvesting[M]. New York： Chapman & Hall， Interational Thomson Publishing， 1995.

[21] Kennedy J A， Matthews M A， Waterhouse A L. Effect of maturity and vine water status on grape skin flavonoids[J].American Journal of Enology and Viticulture， 2002， 53（4）： 268-274.

[22] Spayd S E， Tarara J M， Mee D L， et al. Separation of sunlight and temperature effects on the composition of Vitis vinifera cv. merlot berries[J]. American Journal of Enology and Viticulture， 2002， 53（3）： 171-182.

[23] Steyn W J， Holcroft D M， Wand S J E， et al. Anthocyanin degradation in detached pome fruit with reference to preharvest red color loss and pigmentation patterns of blushed and fully red pears[J]. Journal of The American Society For Horticultural Science， 2004， 129（1）： 13-19.

[24] Ortega-Regules A， Romero-Cascales I， Lopez-Roca J M， et al. Anthocyanin fingerprint of grapes： environmental and genetic variations[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2006， 86（10）： 1 460-1 467.