劉建樂(lè) 白昌軍 嚴(yán)琳玲 張瑜 張龍

摘 要 為了研究不同柱花草品種的鋁脅迫差異，利用水培方法，在苗期對(duì)16份柱花草材料分別在0、10、30、50、70 μmol/L的AlCl3·6H2O溶液中進(jìn)行鋁脅迫研究。分析相對(duì)存活率、株高、根長(zhǎng)、植物量、質(zhì)膜透性、丙二醛含量和脯氨酸含量7個(gè)指標(biāo)。結(jié)果表明，供試的16份柱花草材料均對(duì)鋁離子表現(xiàn)出不同的敏感性。其中在70 μmol/L的AlCl3·6H2O時(shí)，M3和M4的根長(zhǎng)表現(xiàn)出較大的敏感性，在50 μmol/L的AlCl3·6H2O時(shí)，M4和M13的根長(zhǎng)表現(xiàn)出較大的敏感性。通過(guò)綜合評(píng)價(jià)可知，2001-1、2001-79、熱研20號(hào)和Nina材料的耐鋁性較強(qiáng)，2001-84的耐鋁性最弱，其余材料的耐鋁性居中。

關(guān)鍵詞 柱花草；苗期；耐鋁性；綜合評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào) S541 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào) A

柱花草屬（Stylosanthes）有44個(gè)種和亞種，是一種優(yōu)良的熱帶亞熱帶豆科牧草[1]，具有莖葉產(chǎn)量高、植株品質(zhì)好、耐干旱、耐貧瘠等特點(diǎn)[2]，已在澳大利亞、印度尼西亞、馬來(lái)西亞、菲律賓以及非洲和南美洲國(guó)家種植并利用[3]。柱花草在中國(guó)于1962年首次作為膠園覆蓋從馬來(lái)西亞引種到海南[4]，目前已被推廣種植到廣西、廣東、云南、貴州、福建及四川的攀枝花干熱河谷地區(qū)[5]。

鋁是自然界中常見(jiàn)的元素之一，在地殼中含量?jī)H次于氧和硅而位居第3位。土壤中的鋁多以鋁硅酸鹽和氫氧化物固體的形式存在，隨著污水處理的污泥及改良酸性肥料的使用，致使土壤中鋁含量升高，土壤過(guò)度酸化。鋁是酸性土壤中限制作物生長(zhǎng)的主要因子，鋁能抑制植物根系的生長(zhǎng)，使根內(nèi)細(xì)胞不能正常分裂，根的伸長(zhǎng)受到阻礙，植物的地上部分生長(zhǎng)和發(fā)育受到阻礙[6-7]，吸收作用受阻，導(dǎo)致植物抗逆性減弱。不同植物甚至同一植物不同品種，對(duì)鋁的耐性存在差異[8]。中國(guó)華南地區(qū)地處熱帶亞熱帶，氣候高溫多雨，土壤呈酸性，pH值在4.5～6.5之間。黃冬芬等[9]研究結(jié)果表明，鋁對(duì)柱花草的脅迫表現(xiàn)為側(cè)根數(shù)目減少，結(jié)瘤數(shù)減少，從而影響根瘤菌的感染和固氮能力。Du等[10]研究結(jié)果表明，不同基因型的柱花草在酸性土壤中，對(duì)有機(jī)磷的利用效率存在差異。尚未見(jiàn)有關(guān)柱花草耐鋁性的研究報(bào)道。種子萌芽期和苗期是對(duì)脅迫等逆境較為敏感的時(shí)期，因此，本試驗(yàn)對(duì)柱花草16份材料的苗期進(jìn)行耐鋁評(píng)價(jià)，以期為柱花草在酸性土壤地區(qū)的推廣應(yīng)用以及耐鋁育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的16份柱花草材料由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所種質(zhì)庫(kù)提供（表1）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶牧草基地的試驗(yàn)大田中進(jìn)行。于2012年3月2日將16種柱花草材料進(jìn)行播種，在苗期進(jìn)行正常的田間管理。6月1日剪取大小基本一致的苗株枝條，插入裝有營(yíng)養(yǎng)液的箱中。每箱裝入10 L 1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液， 營(yíng)養(yǎng)液成分為：KNO3 2.527 6 g，Ca（NO3）2·4H2O 5.903 8 g，K2SO4 0.436 g，MgSO4·7H2O 2.46 g，ZnSO4·7H2O 0.109 9 mg，CuSO4·5H2O 0.393 mg，KH2PO4 68.042 mg，MnCl2·4H2O 0.905 mg，H3PO3 1.43 mg，F(xiàn)e-EDTA 0.3 g，（NH4）6Mo7O24·4H2O

0.01 mg。用泡沫板固定枝條，每箱15個(gè)孔，每孔3個(gè)扦條。每10 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。7月5日進(jìn)行鋁處理，鋁處理方法[11]為：將六水氯化鋁（AlCl3·6H2O）溶解到水培營(yíng)養(yǎng)液中，分別稀釋為0、10、30、50、70 μmol/L 5個(gè)梯度，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，用1 mol/L的NaOH和HCl調(diào)到pH5.8。經(jīng)過(guò)30 d處理，測(cè)量各材料的存活率、株高、根長(zhǎng)、植物量、相對(duì)質(zhì)膜透性、丙二醛含量、脯氨酸含量，并通過(guò)上述指標(biāo)對(duì)材料進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法 成活率=成活數(shù)/總個(gè)數(shù)。

株高：用尺子測(cè)量植株的垂直高度。每孔測(cè)3株，共測(cè)3孔，以9株高度的均值作為株高。

根長(zhǎng)：用尺子測(cè)量植株的垂直根長(zhǎng)，每孔測(cè)3株，共測(cè)3孔，以9株根長(zhǎng)的均值作為根長(zhǎng)。

植物量：烘干稱重法測(cè)量。每孔測(cè)3株，共測(cè)3孔。

相對(duì)質(zhì)膜透性：利用電導(dǎo)法[12]進(jìn)行測(cè)定。

丙二醛（MDA）含量：取0.5 g葉片將其剪碎，加入10%三氯乙酸5 mL研磨；再加入5 mL TCA溶液充分研磨，勻漿4 000 r/min離心，上清液為提取液。取一試管，吸取2 mL提取液，對(duì)照管加2 mL蒸餾水，各加入2 mL 0.6% TBA溶液，混勻后加塞。置于沸水中加熱15 min，冷卻，以4 000 r/min離心15 min，取上清液測(cè)定OD532和OD450。

脯氨酸（Pro）含量：稱取0.5 g葉片材料，加入3%磺基水楊酸溶液研磨，勻漿至離心管中，在沸水中加熱10 min冷卻，3 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL于具塞試管中，加入2 mL蒸餾水，2 mL冰乙酸和4 mL酸性茚酸酮，搖勻，在沸水中加熱60 min，冷卻至室溫，加入4 mL甲苯，充分振蕩，萃取紅色產(chǎn)物，萃取后靜置分層，待分層后，吸取甲苯，測(cè)定OD520。

指標(biāo)相對(duì)值=處理測(cè)定值/對(duì)照測(cè)定值×100%（1）

耐鋁系數(shù)=不同濃度處理下測(cè)定的平均值/對(duì)照測(cè)定值×100% （2）

利用五級(jí)評(píng)分法[13]，對(duì)各單項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)價(jià)值進(jìn)行定量分析，處理方法如下：

D=（Hn-Hs）/5 （3）

E=（H-Hs）/D+1 （4）

式中Hn表示各指標(biāo)測(cè)定的最大值；Hs表示各指標(biāo)測(cè)定的最小值；H表示各指標(biāo)測(cè)定的任意值；D為得分極差（每得1分之差）；E是各指標(biāo)應(yīng)得分。將各個(gè)指標(biāo)測(cè)定的最大值定為5分，最小值定為1分，將D值代入公式（4）求出任意測(cè)定值的應(yīng)得分E。

CVJ= （5）

Wj= （6）

根據(jù)公式[14]（5）和（6），計(jì)算各指標(biāo)變異系數(shù)及其綜合評(píng)價(jià)體系中權(quán)重系數(shù)。其中CVj為第j個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)，Wj為第j個(gè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)。各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)為相對(duì)存活率0.1，相對(duì)株高0.1，相對(duì)根長(zhǎng)0.1，相對(duì)植物量0.1，相對(duì)質(zhì)膜透性0.2，相對(duì)丙二醛0.2，相對(duì)脯氨酸0.2。

利用公式B=A×R計(jì)算各材料的綜合評(píng)價(jià)值，式中B代表綜合評(píng)價(jià)值，A表示權(quán)重系數(shù)矩陣，R各個(gè)指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化處理值，并根據(jù)綜合評(píng)價(jià)值進(jìn)行名次排序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft office Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋁處理對(duì)柱花草成活率的影響

從表2可見(jiàn)，各材料成活率隨著鋁處理濃度的增加而減小。在10 μmol/L處理下各材料的相對(duì)成活率均為100%；在30 μmol/L處理下只有M2、M11、M12的相對(duì)成活率有所下降，但均在50%以上。在50 μmol/L處理下除M1、M12外，其它材料的相對(duì)成活率均有所下降，其中M9、M11的相對(duì)成活率降到了50%以下。在70 μmol/L處理下，各材料的相對(duì)成活率均下降，最高的為88%，最低的僅有4%。

2.2 鋁處理對(duì)柱花草株高的影響

在鋁處理下，各材料的相對(duì)株高隨濃度的增大而減小。在10 μmol/L的處理下，M1、M2、M3、M4、M11、M15的相對(duì)株高均大于100%，說(shuō)明此濃度的鋁對(duì)試驗(yàn)材料的生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用；在30 μmol/L的處理下，M1、M2、M3、M5的相對(duì)株高大于100%，說(shuō)明此濃度對(duì)其生長(zhǎng)仍有促進(jìn)作用；在50 μmol/L的處理下，M1、M3、M5的相對(duì)株高明顯高于其他材料，表明這些材料有一定的耐鋁能力；在70 μmol/L的處理下，各材料的相對(duì)株高明顯下降，最高的為98%，最低的為31%（表3）。

2.3 鋁處理對(duì)柱花草根長(zhǎng)的影響

在鋁處理下，各材料的相對(duì)根長(zhǎng)隨濃度的增加而減小。在10 μmol/L處理下，M1、M4、M6、M14的相對(duì)根長(zhǎng)大于100%，表明10 μmol/L的鋁處理促進(jìn)了根的生長(zhǎng)；在30 μmol/L的處理下，M4的相對(duì)根長(zhǎng)大于100%，表明30 μmol/L 的鋁對(duì)M4根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；在50 μmol/L的處理下，各材料的相對(duì)根長(zhǎng)均減小，最高為71%，最低為51%；在70 μmol/L的處理下，材料相對(duì)根長(zhǎng)的最大值為49%，最小值為30%（表4）。

2.4 鋁處理對(duì)柱花草植物量的影響

在鋁處理下，各材料的相對(duì)生物量隨濃度的增大而減小。在10 μmol/L處理下，M1、M4、M7、M10、M11、M13的相對(duì)植物量均大于100%，表明此濃度的鋁促進(jìn)了其生長(zhǎng)；在30 μmol/L處理下，各材料的相對(duì)生物量均受到抑制，最高為75%，最低的為60%；在50 μmol/L處理下，除M4、M7、M10、M12外，其他各材料的相對(duì)植物量均小于50%；在70 μmol/L的鋁處理下，各材料的相對(duì)植物量均低于50%，最高為35%，最低為21%（表5）。

2.5 鋁處理對(duì)柱花草質(zhì)膜透性的影響

在鋁處理下，各材料的相對(duì)質(zhì)膜透性隨鋁濃度的增大而增大。細(xì)胞膜系統(tǒng)是植物毒害的主要部位，也是逆境傷害的原初位點(diǎn)。在10 μmol/L處理下，M1、M4、M7、M12、M13的質(zhì)膜相對(duì)透性低于100%，表明此濃度的鋁增強(qiáng)了這些材料抗性；M3、M9、M16的質(zhì)膜相對(duì)透性為100%，表明此濃度的鋁對(duì)這些材料的質(zhì)膜透性沒(méi)有明顯的影響；在30 μmol/L處理下，相對(duì)質(zhì)膜透性最大值為191%，最小值為154%；在70 μmol/L處理下相對(duì)質(zhì)膜透性的平均值為471%，最大值為520%，最小值為416%（表6）。

2.6 鋁處理對(duì)柱花草丙二醛含量的影響

在鋁處理下，各材料的相對(duì)丙二醛含量隨鋁濃度的增大而增大。一般認(rèn)為，丙二醛在植物體內(nèi)是活性氧毒害的表現(xiàn)，含量越高越容易導(dǎo)致植物的抗性減弱。在10 μmol/L處理下M3、M4等9份材料的相對(duì)丙二醛含量大于100%，表明這些材料對(duì)鋁比較敏感；在30 μmol/L處理下所有材料的相對(duì)丙二醛含量均大于100%，最大值為231%，最小值為154%；在70 μmol/L的鋁處理下M10受到的影響最大，相對(duì)丙二醛為487%，M1受到的影響最小，相對(duì)丙二醛含量為341%（表7）。

2.7 鋁處理對(duì)柱花草脯氨酸含量的影響

在鋁處理下，各材料的相對(duì)脯氨酸含量隨鋁濃度的增加而增大。由于合成蛋白質(zhì)受阻可能導(dǎo)致游離脯氨酸的大量積累。在10 μmol/L處理下只有M13的相對(duì)脯氨酸含量大于100%其余均小于100%，表明此濃度的鋁降低了M13的抗逆性；在30 μmol/L處理下M7、M8、M9、M13、M15、M16的相對(duì)脯氨酸含量大于100%，此濃度下材料的相對(duì)脯氨酸的最大值為111%，最小值為84%；在50 μmol/L處理下M2、M4、M5、M6、M10、M11的相對(duì)脯氨酸含量均小于100%，表明此濃度的鋁增加了這些材料的抗逆性；在70 μmol/L處理下，這些材料相對(duì)脯氨酸的平均值為114%，最大為127%，最小值為101%（表8）。

2.8 鋁處理下各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化處理

在鋁處理下，相對(duì)成活率最大的為5.72，最小值為1.74，平均值為3.32。相對(duì)株高最大的為6，最小值為2.53，平均值為4.11。相對(duì)根長(zhǎng)最大的為5.79，最小值為1，平均值為3.34。相對(duì)植物量最大的為5.51，最小值為1.87，平均值為3.80。相對(duì)質(zhì)膜透性最大的為5.22，最小值為1，平均值為3.34。相對(duì)丙二醛最大的為5.02，最小值為1.56，平均值為3.36。相對(duì)脯氨酸最大的為6，最小值為1.27，平均值為3.81（表9）。

2.9 各材料的綜合排名

在鋁處理下，綜合評(píng)價(jià)值最高的為M1、M10、M6，最低的為M8、M11、M16，其余處于中間。綜合評(píng)價(jià)值最高的為5.014，最低的為2.236，平均綜合評(píng)價(jià)值為3.600（表10）。

3 討論與結(jié)論

在鋁脅迫下對(duì)16份柱花草進(jìn)行耐鋁評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：M1、M6、M10、M13這4份種質(zhì)耐鋁性較強(qiáng)，其中M1在這16份種質(zhì)中耐鋁性表現(xiàn)為最強(qiáng)。這和黃冬芬的研究結(jié)果一致[9]。柱花草生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶地區(qū)，該地區(qū)大部分土壤是酸性，土壤pH一般為4～5，鋁離子的活度比北方堿性土壤的要高。因此，柱花草具有不同程度的耐鋁能力。M2、M16、M11、M8這4份種質(zhì)的耐鋁性較弱，其中M8的耐鋁性最弱。其余材料的耐鋁能力居中。

在鋁脅迫下，柱花草體內(nèi)的生理代謝會(huì)發(fā)生紊亂。鋁脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響最突出的表現(xiàn)為抑制根的生長(zhǎng)[15]。而根尖是鋁脅迫的最主要部分[16]，導(dǎo)致根尖細(xì)胞分裂受阻礙，因而根的伸長(zhǎng)常常被作為鋁脅迫的最有效的評(píng)價(jià)指標(biāo)。鋁對(duì)地上部的影響沒(méi)有地下部明顯，Meda等[15]報(bào)道短時(shí)間內(nèi)鋁脅迫對(duì)22個(gè)熱帶豆科牧草的生物量影響沒(méi)有差異。通過(guò)水培試驗(yàn)，M1表現(xiàn)出比較耐鋁， 而M8對(duì)鋁脅迫比較敏感。不同品種柱花草對(duì)鋁脅迫的耐性可能與根系對(duì)鋁的吸收有關(guān)。柱花草耐鋁機(jī)制可能跟鋁的外排機(jī)制有關(guān)。大部分植物抵御鋁脅迫的方式是通過(guò)外排（小麥、玉米）[16]。Li等[17]對(duì)不同品種柱花草進(jìn)行高鋁處理，發(fā)現(xiàn)根系分泌檸檬酸差異與柱花草耐鋁差異有一定的關(guān)系。Wang等[18]和林咸永等[19]研究發(fā)現(xiàn)，耐鋁小麥品種在鋁脅迫下能維持較高的pH。本研究結(jié)果表明，在10 μmol/L處理下，M1、M4、M6、M14的相對(duì)根長(zhǎng)大于100%，表明10 μmol/L的鋁處理促進(jìn)了根的生長(zhǎng)，但促進(jìn)柱花草生長(zhǎng)的最適鋁離子濃度還需要進(jìn)一步研究。隨著鋁濃度的增加，柱花草的相對(duì)成活率、相對(duì)株高、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)生物量下降，相對(duì)質(zhì)膜透性、相對(duì)丙二醛含量、相對(duì)脯氨酸含量升高。在70 μmol/L的鋁處理下植物的平均相對(duì)成活率不到50%，說(shuō)明此濃度已不利于柱花草的正常生長(zhǎng)。

鋁脅迫對(duì)柱花草的影響是多方面的，不僅表現(xiàn)在形態(tài)、生理生化方面，而且與柱花草的不同生育期有關(guān)。本文僅在水培條件下，對(duì)柱花草的相對(duì)成活率、相對(duì)株高、相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)生物量、相對(duì)質(zhì)膜透性、相對(duì)丙二醛含量、相對(duì)脯氨酸含量7個(gè)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量，因此對(duì)柱花草的評(píng)價(jià)有一定的局限性，在實(shí)際工作中最好采取實(shí)驗(yàn)和田間觀察、單一指標(biāo)和多指標(biāo)相結(jié)合的方式進(jìn)行評(píng)價(jià)。

參考文獻(xiàn)

[1] 周碧燕， 郭振飛. ABA及其合成抑制劑對(duì)柱花草抗冷性及抗氧化酶活性的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2005， 14（6）： 94-99.

[2] 梁英彩. 907柱花草的選育研究[J]. 草業(yè)科學(xué)， 1998， 15（4）： 27-29， 34.

[3] 武保國(guó). 柱花草[J]. 農(nóng)村養(yǎng)殖技術(shù)， 2003（8）： 24.

[4] 華南熱帶作物研究院熱作所農(nóng)學(xué)組. 巴西苜蓿引種栽培試驗(yàn)報(bào)告[J]. 熱帶作物研究， 1981（6）： 73-77.

[5] 蔣昌順. 柱花草的研究進(jìn)展[J]. 熱帶作物研究， 2005， 26（4）： 104-108.

[6]何麗爛， 喻 敏， 王惠珍， 等. 豌豆根尖鋁毒的敏感濃度探討[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 29（1）： 45-47.

[7] 龐貞武. 鋁毒快速抑制水稻根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)的生理機(jī)制研究[D]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2009.

[8] 黃秀梨. 微生物學(xué)[M]. 北京： 高等教育出版社， 1998（8）： 194-202.

[9] 黃冬芬， 王朋， 文稀， 等. 4份柱花草耐鋁脅迫的差異[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2012， 33（1）： 15-19.

[10] Mannetje L T. Considerations on the taxonomy of the genus Stylosanthes[A]. In： Stace H M， Edye L A. The Biology and Agronomy ofStylosanthes[M]. Sydney， Australia： Academic Press， 1984： 1-21.

[11] 孫桂枝， 張 耿， 王 贊， 等. 貓尾草屬牧草苗期耐鹽性評(píng)價(jià)[J]. 草原與草坪， 2007（5）： 15-18.

[12] 李 玲. 植物生理學(xué)模塊實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2009.

[13] 賈亞雄. 披堿草野生種質(zhì)材料芽期耐鹽性研究[J]. 草原與草坪， 2007（2）： 47-52.

[14] 陸 宇， 袁慶華. 三葉草屬牧草苗期耐鈷性評(píng)價(jià)[J]. 草原與草坪， 2009（1）： 32-36.

[15] Meda A R， Furlani P R. Tolerance to aluminum toxicity by tropical leguminous plant used as cover crops[J]. Brazilian Archives of Biology and Technology， 2005， 48（2）： 309-317.

[16] Archambault D J， Zhang G， Taylor G. Spatial variation in thekinetics of aluminum（Al）uptakte in roots of wheat（Triticumaestivum L.）exhibiting differential resistance to Al. Evidencefor metabolism-dependent exclusion of Al[J]. Journal of PlantPhysiology， 1997， 151： 668-674.

[17] Li X F， Zuo F H， Ling G Z， et al. Secretion of citrate from roots in response to aluminum and low phosphorus stresses in Stylosanthes[J]. Plant and Soil， 2009， 325： 219-229.

[18] Wang P， Bi S， Ma L， Han W. Aluminum tolerance of two wheat cultivars（Brevor and Atals66）in relation to their rhizosphere pH and organic acids exuded from roots[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54： 10 033-10 039.

[19] 林咸永， 章永松， 羅安程， 等. 鋁脅迫下不同小麥基因型根際pH的變化、 NH4+和NO3-吸收及還原與其耐鋁性的關(guān)系[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)， 2002， 8： 330-334.