卞 華，申 晴，韋海燕，蔣亞君，丁西朋，白昌軍

（1. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737）

柱花草(Stylosanthesspp.)屬于自花授粉植物，為多年生豆科牧草，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐酸瘠土、耐干旱和飼草產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)[1]，是全球熱帶及亞熱帶地區(qū)廣泛種植的優(yōu)良牧草[2]。自20世紀(jì)80年代初，我國大量引進(jìn)柱花草種質(zhì)資源，并將其廣泛應(yīng)用于土壤改良、水土保持及林草間作。隨著柱花草種質(zhì)資源的不斷引進(jìn)和改良，形成了國內(nèi)獨(dú)特而豐富的柱花草種質(zhì)資源[3]。柱花草屬包含的種和變種約50個(gè),圭亞那柱花草(S. guianensis)、有鉤柱花草(S. hamata)、頭狀柱花草(S. capitata)、灌木粘質(zhì)柱花草(S. seabrana)、矮柱花草(S. humilis)等為常見的栽培種[4]。

環(huán)境和人工選擇引起的遺傳變異豐富了柱花草種質(zhì)資源的基因類型。近年來，人們越來越重視柱花草種質(zhì)資源的開發(fā)和利用，柱花草種質(zhì)資源遺傳背景也變得越來越復(fù)雜[4]。加深遺傳背景的研究及遺傳多樣性的分析有利于柱花草種質(zhì)資源分類、收集、保存和利用[4]。近年來，柱花草種質(zhì)資源的研究主要集中在遺傳多樣性上，學(xué)者們利用SSR、SRAP、ISSR和RAPD等分子標(biāo)記技術(shù)對來源不同的柱花草材料進(jìn)行分類[5-9]。這些研究充分揭示了柱花草種質(zhì)資源復(fù)雜的遺傳背景和豐富的遺傳多樣性[10]，但關(guān)于柱花草群體結(jié)構(gòu)分析的研究鮮有報(bào)道。

目前，群體結(jié)構(gòu)分析在水稻(Oryza sativa)[11]、玉米(Zea mays)[12]、大豆(Glycine max)[13]等大田作物中已經(jīng)得到應(yīng)用，關(guān)于柱花草群體結(jié)構(gòu)的分析尚未深入開展。本研究利用SSR標(biāo)記分析了68份柱花草材料的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，這對揭示柱花草種質(zhì)資源間進(jìn)化關(guān)系、加快柱花草資源利用效率和優(yōu)良親本的選配有著重要的意義[14]。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為來自12個(gè)柱花草種的68份種質(zhì)資源(表1)。其中有鉤柱花草18份，細(xì)莖柱花草(S.gracilis)、圭亞那柱花草各9份，頭狀柱花草、灌木粘質(zhì)柱花草各7份，狹葉柱花草(S. angustifolia)5份，大葉柱花草(S. grandifolia) 4份，卡爾奇柱花草(S. calcicola) 3份，其余4個(gè)種共6份柱花草種質(zhì)資源。

上述材料均保存在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所基地，試驗(yàn)材料分小區(qū)按編號順序種植，每份材料種植15株，株間距20 cm，行間距2 m，列間距1.5 m，常規(guī)大田管理。

1.2 DNA提取與檢測

采集營養(yǎng)生長時(shí)期的柱花草嫩葉，每份材料采集5株，每株選取3片嫩葉，在液氮中混合研磨成粉末，根據(jù)張龍改良的CTAB法[15]，提取基因組DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品質(zhì)量及純度，利用超微量分光光度計(jì)(GE Healthcare)測定DNA樣品的濃度，將DNA樣品濃度用無菌水稀釋到 100 ng·μL-1，并放置-20 ℃ 備用。

1.3 SSR引物來源和PCR擴(kuò)增體系

從利用熱研5號柱花草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)并驗(yàn)證的523對SSR引物中篩選出多態(tài)性好、條帶清晰的30對引物[16](表2)，由上海生工生物工程公司合成，對所有材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。并對不同引物在不同種中的擴(kuò)增情況以及不同材料的多態(tài)性進(jìn)行分析。 PCR擴(kuò)增擴(kuò)增條件和程序根據(jù)丁西朋等[17]描述的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)收集與分析

以DL2000DNA Marker作為分子量參考，用Excel對條帶進(jìn)行“0，1”系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”。利用PopGen1.32軟件分析引物的等位基因數(shù)、等位基因頻率和Shannon-Wiener多樣性指數(shù)。并計(jì)算各個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量(poiymorphism information content, PIC)。

式中：n代表每個(gè)位點(diǎn)檢測到的等位基因數(shù)目，Pi、Pj是第i、j種等位位點(diǎn)占總等位位點(diǎn)的百分率[18]。通過NTSYS-pc 2.10e軟件計(jì)算出柱花草種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù) (Genetic similarity coefficient, GS)，然后以GS值為基礎(chǔ)根據(jù)非加權(quán)組平均法 (UPGMA)對試驗(yàn)材料進(jìn)行系統(tǒng)的聚類分析[19]，得到對應(yīng)的tree plot，并用mantel檢測其相關(guān)性?；诜肿訑?shù)據(jù)采用Structure 2.3.4軟件[20]對柱花草群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，先將K值設(shè)為1～10，開始時(shí)的不作數(shù)迭代設(shè)為10 000次，其后的MCMC設(shè)為100 000次，每個(gè)K值獨(dú)立重復(fù)運(yùn)行10次[12]。依據(jù)似然值最大原則從lnP(D)中選擇所合適的K值，若lnP(D)一直隨K值增大而不斷增大，則依據(jù)Evanno等[21]提出的△K值分析法來確定最終的K值

表 1 供試柱花草種質(zhì)資源信息Table 1 The Stylosanthes germplasm used in this study

續(xù)表 1Table 1 (Continued)

表 2 供試SSR引物Table 2 SSR primers used in this study

lnP(D)即L(K)。并根據(jù)基因組變異源在該群體中的概率Q值[22]，分析群體結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR擴(kuò)增結(jié)果

本研究利用30對SSR引物對68份柱花草種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析(圖1)。30對SSR引物在68份柱花草材料中共擴(kuò)增出146個(gè)等位基因，每個(gè)SSR標(biāo)記的等位基因數(shù)為2～7個(gè)，平均觀測等位基因數(shù)為4.867個(gè)。其中等位基因最多的是RM116、RM301和RM65，最少的是RM77。30個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)I值和PIC值的變化范圍分別0.676～1.690 和0.363～0.764，平均為 1.195 和0.577。各遺傳多樣性參數(shù)均顯示RM77的多態(tài)性最低，RM301的多態(tài)性最高(表3)。

圖 1 引物RM113、RM369在38份柱花草中的擴(kuò)增情況Figure 1 Amplified results of primer RM113，RM369 in 38 accessions

表 3 68份柱花草材料遺傳多樣性EST-SSR分析Table 3 EST-SSR genetic diversity analysis of 68 Stylosanthes accessions

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1 遺傳相似系數(shù)分析

基于30個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記的帶譜，利用NTSYS-pc 2.10e分析不同來源的68份柱花草材料的遺傳多樣性。研究顯示，供試材料間的遺傳相似系數(shù)介于0.493～0.986，平均為0.739。其中南01082與南01083圭亞那柱花草遺傳相似性最大。而CIAT58與CIAT147有鉤柱花草的遺傳相似系數(shù)最低，為0.493。從各柱花草種質(zhì)間平均相似系數(shù)來看，CIAT2510與其他材料的平均相似系數(shù)最低，為0.638，表明CIAT2510與其他種質(zhì)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；Fine stem stylo與其他材料的平均相似系數(shù)最高，為0.856，其次為CIAT122柱花草，為0.849。不同材料之間的遺傳相似系數(shù)值大多分布在0.600～0.800，這部分所占比例高達(dá)到82.61%，相似系數(shù)小于0.600的占3.27%(圖2)，這表現(xiàn)出68份柱花草材料遺傳基礎(chǔ)的異質(zhì)性，柱花草種質(zhì)資源的多樣性。

圖 2 68份柱花草種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)Figure 2 The analysis of the similarity coefficient between the 68 accessions

2.2.2 聚類分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)將供試的68份柱花草材料根據(jù)UPGMA法進(jìn)行聚類分析(圖3)，由聚類圖可以看出，在相似系數(shù)0.730處所有參試材料可明顯劃分為六大類群。第Ⅰ類群包括24份種質(zhì)材料。在相似系數(shù)0.750處可分為2個(gè)亞類：第1亞類以細(xì)莖柱花草為主，包括2份尖葉柱花草、1份圭亞那柱花草、7份細(xì)莖柱花草、4份大葉柱花草和2份馬弓形柱花草。第2亞類包括8份材料，均為圭亞那柱花草，其中南01082與南01083親緣關(guān)系最近。第Ⅱ類群以狹葉柱花草為主，包括5份狹葉柱花草、1份有鉤柱花草和2份矮柱花草。第Ⅲ類群只包括9、11和10號材料，均為卡爾奇柱花草。第Ⅳ類群包括19份種質(zhì)材料，在相似系數(shù)0.820處可分為3個(gè)亞類：第1、2亞類分別為RSKCal009法爾孔柱花草和CIAT1361細(xì)莖柱花草，第3亞類為17份有鉤柱花草。第Ⅴ類群為7份灌木粘質(zhì)柱花草材料。第Ⅵ類群為7份頭狀柱花草材料。

2.3 不同來源柱花草種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)試驗(yàn)所得SSR分子數(shù)據(jù)，使用Structure軟件對供試柱花草進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析。由于似然值隨K值的增大而不斷增大，為選擇合適的K值，參考Evanno等[21]的方法，繪制ΔK隨著K值增大的變化曲線 (圖 4)，當(dāng) ΔK最大時(shí)，K= 6，因此將參試材料劃分6個(gè)類群。在68份柱花草的遺傳結(jié)構(gòu)圖中(圖5)，不同的顏色代表不同的群體，按順序分別為紅色、綠色、藍(lán)色、黃色、紫色、青色，以上顏色分別代表1～6個(gè)群體，縱坐標(biāo)表示各群體的種質(zhì)占其群體祖先成分的比例，即Q值，橫坐標(biāo)表示各種質(zhì)序號。本研究參照劉麗華等[23]的研究，將Q ≥ 0.600視為血緣相對比較單一，Q＜0.600視為具有混合來源。

分析各柱花草材料在不同類群中的Q值發(fā)現(xiàn)，68份柱花草材料中的62份材料(91.18%)在某一類群中的Q ≥ 0.600，遺傳基礎(chǔ)比較單一，分到了某一個(gè)類群中。而其余的6份柱花草材料(8.82%)在每一類群中的Q＜0.600，遺傳結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，沒有明確的類群歸屬特性，形成了一個(gè)混合群體 (表 4)。

分析劃入指定群體的62份柱花草材料發(fā)現(xiàn)，在6個(gè)類群中，類群1(紅色)的材料共12份，頭狀柱花草7份狹葉柱花草5份，占群體的17.65%。類群2(綠色)中材料的遺傳成分較為復(fù)雜共16份，占群體的23.53%，各材料的成分值為69.10%～99.60%，其中有3份材料遺傳背景比較復(fù)雜，按Q值從小到大依次是1、2、43號。分入類群3 (藍(lán)色)的材料最多，有17份，占總體的25.00%，主要為有鉤柱花草，各材料的成分值為83.70%～97.40%，這些材料親緣關(guān)系比較近，遺傳基礎(chǔ)差異不大,其中57號材料Q值最小,遺傳背景比較復(fù)雜。類群 4 (黃色)共包含 7份材料，Q＞0.900， 種質(zhì)來源單一的全部為灌木粘質(zhì)柱花草，這表明材料遺傳背景簡單，與其他亞類間缺少基因交流。歸入類群5(紫色)的材料最少(3個(gè))，占總材料的4.41%，包含全部3份卡爾奇柱花草。類群6(青色)包含7份材料，均為圭亞那柱花草，占群體的10.29%，各材料的成分值為71.7%～99.5%，其中19號材料遺傳背景比較復(fù)雜，Q值最小(圖 5)。

圖 3 68份材料遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類圖Figure 3 UPGMA dendrogram of 68 accessions based on genetic similarity coefficient

2.4 聚類分析與群體結(jié)構(gòu)分析的比較

通過計(jì)算材料間的遺傳距離，聚類分析將距離近的材料聚在一起。而Structure分析是將材料預(yù)先設(shè)定幾個(gè)類群，然后計(jì)算每個(gè)位點(diǎn)的等位基因頻

圖 4 K值曲線圖Figure 4 Gurve diagram of K value

率和遺傳相似性比例，遺傳相似比例高的材料被劃分在同一個(gè)類群。聚類分析可以從宏觀上顯示材料的遺傳一致性程度，基于模型的Structure分析可以計(jì)算出材料之間的共祖度，從更微觀角度解釋材料的遺傳背景[24]。結(jié)果顯示，兩種方法對68份柱花草材料類群的劃分中，遺傳背景單純的材料類群劃分情況大致統(tǒng)一，例如在群體結(jié)構(gòu)分析中被單獨(dú)劃分成一個(gè)類群的7份灌木粘質(zhì)柱花草，在聚類分析中也聚在一起[25]；同樣的情況也適用于3份卡爾奇柱花草。在群體結(jié)構(gòu)分析中歸入第3亞類的有鉤柱花草，在聚類中也都劃在了第IV類群。上述兩種分析方法在對遺傳背景復(fù)雜、多種來源的材料的類群劃分結(jié)果上有些差異，如聚類分析中聚到第IV類群的20和37號，而在群體結(jié)構(gòu)分析中，則與遺傳組成比較復(fù)雜的7、60、66、67號分到了混合群體中。在聚類分析中29、30、31、44、45、46號聚到了第I類群，而在群體結(jié)構(gòu)分析中根據(jù)Q值則單獨(dú)劃分成為第6類群。

3 討論與結(jié)論

圖 5 68份柱花草種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)分析(K=6)Figure 5 Population structure of 68 Stylosanthes germplasm (K=6)

SSR標(biāo)記具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，如數(shù)量豐富、多態(tài)性高、操作簡單和重復(fù)性好，這使SSR技術(shù)應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域[26]。Santos-Garcia等[27]利用20個(gè)共顯性強(qiáng)的SSR標(biāo)記，對150份植物學(xué)分類存在爭議的柱花草材料進(jìn)行了遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析。Chandra等[28]研究并開發(fā)133個(gè)柱花草SSR標(biāo)記，用于柱花草物種內(nèi)的遺傳改良。孫友位等[29]通過利用SSR分子標(biāo)記研究玉米375個(gè)自交系間的遺傳變異，認(rèn)為SSR能夠有效地揭示自交系之間的遺傳多樣性。此外其他學(xué)者利用STS、RFLP及ITS等分子標(biāo)記和葉綠體DNA序列差異對柱花草屬種間分類進(jìn)行了研究[30-32]。在本研究中，30對引物在68份柱花草中均能有效擴(kuò)增，共檢測到146個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。在這30對引物中，有8對引物在柱花草遺傳連鎖圖譜中被定位在5個(gè)不同的連鎖 群[33]，其中RM63、RM243、RM424被定位在1號連鎖群，RM65被定位在2號連鎖群，RM47、RM444被定位在4號連鎖群，RM92被定位在7號連鎖群，RM145被定位在8號連鎖群，充分表明這些標(biāo)記在整個(gè)基因組較分散，能夠有效地鑒定柱花草種質(zhì)間的遺傳背景和親緣關(guān)系。

表 4 68份材料的群體結(jié)構(gòu)Table 4 Population structure of 68 materials

續(xù)表 4Table 4 (Continued)

利用SSR數(shù)據(jù)對68份柱花草材料進(jìn)行聚類分析，從結(jié)果來看，約82.61%試驗(yàn)材料的相似系數(shù)分布在0.600～0.800，與Karia等[34]、唐燕瓊等[35]得出柱花草種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富的結(jié)果一致。其中南01082與南01083有鉤柱花草，遺傳相似性最大，這和它們擁有相同的基因組類型有關(guān)。CIAT11052灌木粘質(zhì)柱花草與南00904矮柱花草親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳相似性最小。群體結(jié)構(gòu)就是一個(gè)群體內(nèi)存在的亞群情況。Wang等[36]在玉米研究中將結(jié)構(gòu)相對單一的判斷標(biāo)準(zhǔn)定為Q = 0.800，劉麗華等[23]在小麥 (Triticum aestivum)中定為 Q = 0.600，由于用于研究的材料復(fù)雜程度不同，因此本研究將Q(各個(gè)體歸入某一類群的概率)≥ 0.600視為結(jié)構(gòu)相對單一，將參試柱花草種質(zhì)材料分為6個(gè)類群。占總數(shù)91.18%的62份材料Q＞0.600，遺傳組分單一。6份材料Q＜0.600，遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜。在這6個(gè)類群中，遺傳多樣性水平最高的是類群2，包含的尖葉柱花草、細(xì)莖柱花草、大葉柱花草、馬弓形柱花草及少量的圭亞那柱花草，而這些種質(zhì)的基因組均為G基因組，這與丁西朋等[26]的研究結(jié)果一致。類群3和類群6中均含有有鉤柱花草和矮柱花草，它們都來源于南美洲，有鉤柱花草的基因組為AA或AACC，而矮柱花草的基因組為CC，C基因組與AACC的的遺傳關(guān)系很近，已經(jīng)被多次證實(shí)[26]。類群2和類群6均有圭亞那柱花草，但類群6多為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所引進(jìn)后經(jīng)多次選育而成的柱花草材料，類群2為從哥倫比亞國際熱帶農(nóng)業(yè)中心引進(jìn)的種質(zhì)，這些種質(zhì)采集于巴西、委內(nèi)瑞拉等南美洲地區(qū)，不同地理環(huán)境的相同種質(zhì)選育同樣造成了基因間的差異。本研究證明，劃入混合群體的材料(8.82%)，不同類群間的柱花草材料存在分子水平基因交流，因此在選擇這些材料作為育種親本時(shí)，除考慮材料間的親疏關(guān)系外，還要考慮其復(fù)雜的遺傳組分[37]。

在聚類分析中，當(dāng)相似系數(shù)為0.730時(shí)，68份柱花草種質(zhì)資源可分為6類。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ這4類比較集中，和Ⅴ、Ⅵ類相對分散，這種分布與倍性及基因組類型有關(guān)，與Vogel將柱花草劃分為Styposanthes(包含二倍體和多倍體)和Stylosanthes(完全為二倍體)兩大分支的分類情況基本一致[38]。第Ⅰ大類中7份細(xì)莖柱花草聚為亞類iii，尖葉柱花草、大葉柱花草、馬弓柱花草和所有圭亞那柱花草聚在一起，他們都為二倍體且含有G類基因組[39]，親緣關(guān)系較近，這與前人研究結(jié)果[40-41]一致。在本研究中第Ⅰ大類主要包括細(xì)莖柱花草和所有圭亞那柱花草、大葉柱花草資源，這一大類具有掌狀三出復(fù)葉，不開叉龍骨瓣，小葉較長，綠色莖色等植物學(xué)形態(tài)。第Ⅲ亞類主要包括矮柱花草和有鉤柱花草材料，明顯特征是具有氈毛型莖毛。第Ⅵ大類包括7份材料，均為頭狀柱花草，這一類大多具有紫色或紅褐色莖，橢圓形或卵圓形葉等明顯特征。聚類分析得到的結(jié)果與實(shí)際植物學(xué)分類結(jié)果[42]比較一致，說明這種評價(jià)方式是可行的。

本研究結(jié)果表明，在大多數(shù)材料的劃分上，上述兩種分析方法都保持一致性，對于那些因遺傳背景復(fù)雜在群體分析中處于混合亞類的材料，則存在一定程度的差異性。在遺傳背景研究方面，群體結(jié)構(gòu)分析比遺傳多樣性分析能進(jìn)一步表示出育種材料的內(nèi)在遺傳結(jié)構(gòu)，研究者可以更有針對地進(jìn)行材料的選擇[25]。柱花草種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，這些數(shù)據(jù)可以提供補(bǔ)充信息，對現(xiàn)有種質(zhì)資源的保存工作具有重要意義，并有助于規(guī)劃新的采集行程。此外，揭示其遺傳基礎(chǔ)的異質(zhì)性，對后續(xù)關(guān)聯(lián)分析和挖掘優(yōu)良基因至關(guān)重要[14]。