史 媛，謝克亮，于泳浩，王 濤（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院麻醉科，天津300052）

氫氣對(duì)重度膿毒癥小鼠腸道損傷的保護(hù)作用*

史 媛，謝克亮，于泳浩，王 濤
（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院麻醉科，天津300052）

目的觀察氫氣吸入對(duì)重度膿毒癥小鼠腸黏膜屏障功能、腸道組織氧化還原狀態(tài)的影響，并探討其機(jī)制。方法選取美國癌癥研究所雄性小鼠56只，體質(zhì)量20～25 g，均為5周齡，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為四組：假手術(shù)組（A組）、假手術(shù)+氫氣組（B組）、膿毒癥組（C組）和膿毒癥+氫氣組（D組），每組14只。采用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法制備小鼠膿毒癥模型。B組和D組于CLP后1、6 h吸入2%氫氣1 h。CLP后24 h進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分；采集靜脈血檢測血中生化指標(biāo)[丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）]；隨后處死小鼠取中段空腸，對(duì)腸道組織進(jìn)行原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL）染色，觀察腸道組織細(xì)胞凋亡情況并評(píng)分；檢測血液及腸道組織勻漿中丙二醛（MDA）水平及過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活力。結(jié)果與A組比較，C組和D組行為學(xué)評(píng)分、腸道組織凋亡指數(shù)、血生化指標(biāo)（ALT、AST、BUN、Cr）水平及血清和腸道組織MDA水平升高，SOD和CAT活力降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而B組上述指標(biāo)與A組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與C組比較，D組行為學(xué)評(píng)分、腸道組織凋亡指數(shù)、血生化指標(biāo)水平及血清和腸道組織MDA水平降低，SOD和CAT活力升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論氫氣吸入對(duì)重度膿毒癥小鼠腸損傷和腸黏膜屏障功能破壞有明顯保護(hù)作用，可能與其抗凋亡作用及對(duì)內(nèi)源性氧化還原平衡狀態(tài)的維持有關(guān)。

膿毒癥； 腸黏膜； 氫； 氧化性應(yīng)激； 腸； 細(xì)胞凋亡

膿毒癥是臨床上常見的一種復(fù)雜的綜合征，病理生理特征為炎癥系統(tǒng)過度激活所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、氧化應(yīng)激損傷、高凝狀態(tài)、組織低灌注導(dǎo)致的全身組織缺氧、代償性抗炎反應(yīng)綜合征及最終階段的多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction，MODS）[1]。越來越多的研究表明，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生及抗氧化防御系統(tǒng)功能的降低在膿毒癥的發(fā)病過程中起著重要作用[1]。因此，近來研究者們將膿毒癥治療的重點(diǎn)從控制失控的炎性反應(yīng)轉(zhuǎn)移到對(duì)ROS的清除和機(jī)體氧化還原平衡的維持方面。

腸道組織在腸腔內(nèi)容物與機(jī)體之間形成2層屏障：物理/解剖屏障和免疫屏障。物理屏障是由一層互相聯(lián)結(jié)在一起的上皮細(xì)胞構(gòu)成，上皮細(xì)胞與固有層共同構(gòu)成腸道黏膜層[2-3]。腸道黏膜一方面負(fù)責(zé)腸腔內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，同時(shí)把腸腔內(nèi)多種有毒的物質(zhì)與身體隔離開。腸道組織內(nèi)這一微妙的平衡機(jī)制的破壞是多種疾病發(fā)生的基礎(chǔ)[4]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)，腸道屏障功能破壞能造成腸腔內(nèi)抗原、微生物和有害代謝產(chǎn)物向血循環(huán)中移位，在多種炎癥性疾病的發(fā)病過程中起到重要作用，如手術(shù)后或創(chuàng)傷后SIRS、膿毒癥和MODS[5-9]。前期的研究已經(jīng)證實(shí)，膿毒癥中即使通過控制血流的方法改善組織氧合，腸道組織仍是極易受累的器官[5-6]。腸道功能的改變在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，受損的腸道組織通過促進(jìn)病原微生物的侵襲及細(xì)菌毒性代謝產(chǎn)物的移位，在SIRS的發(fā)生中起著重要的推動(dòng)作用[7-8]，從而產(chǎn)生了一種新的理論——腸道是膿毒癥發(fā)病的動(dòng)力器官[10]。因此，膿毒癥患者腸道功能的改變受到特別重視，而腸黏膜屏障功能失調(diào)是膿毒癥患者最常見的腸道并發(fā)癥[11]。腸黏膜屏障功能失調(diào)可以促進(jìn)腸道菌群的異常增殖和細(xì)菌異位，導(dǎo)致二重感染和MODS的發(fā)生[12]。腸黏膜屏障功能失調(diào)的機(jī)制可能包括膿毒癥全身炎癥細(xì)胞的異常激活與促炎性細(xì)胞因子的大量釋放，氧自由基的大量產(chǎn)生造成氧化應(yīng)激狀態(tài)[11]，這也是造成膿毒癥患者M(jìn)ODS、膿毒性休克甚至死亡的重要原因。因此，針對(duì)腸黏膜屏障功能失調(diào)的有效治療措施有可能為臨床膿毒癥患者的治療帶來新的希望。

本研究擬利用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法誘導(dǎo)的小鼠重度膿毒癥模型，通過全身各主要臟器生化指標(biāo)[丙二醛（MDA）水平及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活力]的測定證實(shí)膿毒癥全身損傷的存在，在此基礎(chǔ)上給予2%氫氣吸入治療，以明確氫氣的抗氧化特性及對(duì)機(jī)體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)功能的影響在模型中發(fā)揮的治療作用。并重點(diǎn)觀察給予氫氣治療后重度膿毒癥小鼠模型中腸道組織的病理變化和細(xì)胞凋亡情況，并進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取美國癌癥研究所雄性小鼠56只，體質(zhì)量20～25 g，均為5周齡（購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。置于清潔環(huán)境中，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，飲自來水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，室溫18～22℃，相對(duì)濕度60%～80%，自然晝夜光線照明，常規(guī)飼養(yǎng)觀察1周后使用。采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為四組：假手術(shù)組（A組）、假手術(shù)+氫氣組（B組）、膿毒癥組（C組）及膿毒癥+氫氣組（D組），每組14只。

1.1.2 模型建立 參照文獻(xiàn)[13]采用CLP法制備小鼠膿毒癥模型。腹腔注射2%水合氯醛15 mL/kg麻醉，常規(guī)腹部聚維酮碘消毒，備皮，鋪無菌洞巾。沿小鼠腹正中線切口約1 cm，用無菌鑷探查到盲腸后，用手術(shù)縫線在回盲瓣下方盲腸近段1/4處結(jié)扎盲腸（避免結(jié)扎回腸及盲腸系膜血管），用20 G無菌針頭貫通穿刺盲腸，擠壓盲腸，使其內(nèi)容物沿穿孔部位擠出0.3 mL，將盲腸還納腹腔，逐層關(guān)腹。A組和B組僅暴露盲腸。

1.2 方法

1.2.1 氫氣治療 采用GCH-300高純氫氣發(fā)生器（天津同普分析儀器科技有限公司）提供氫氣，將小鼠放入密閉的樹脂玻璃箱內(nèi)，入氣口輸入4 L/min的氫氣和空氣混合氣，PG610氫氣檢測儀（河南英特電器設(shè)備公司）監(jiān)測箱內(nèi)氫氣濃度[14]。B、D組于CLP后1、6 h時(shí)吸入2%氫氣1 h，A、C組小鼠僅放于玻璃箱內(nèi)，不吸入氫氣。

1.2.2 行為學(xué)評(píng)分 每組各任選7只小鼠，CLP后24 h進(jìn)行結(jié)膜炎、毛發(fā)豎立、腹瀉、昏睡程度評(píng)分，各項(xiàng)得分為0～3分：0分為無，1分為輕度，2分為中度，3分為重度，總分12分。

1.2.3 血清和腸道組織中MDA、CAT及SOD測定 每組各取7只小鼠采取血漿。方法：沿胸骨正中作一切口，進(jìn)入胸腔，暴露心臟滿意后，將一預(yù)先肝素化的1 mL空針刺入左心室，取血1 mL，迅速在4℃、3 000 r/min離心10 min。離心后，取上清液裝入凍存管，-80℃冰箱中保存直至氧化指標(biāo)的測定。采集血樣后，處死小鼠取小腸組織勻漿，4℃、10 000 r/min離心15 min，取上清液，同樣方法冷凍保存。用分光光度法測定MAD、SOD及CAT（試劑盒購自Cayman Chemical公司），嚴(yán)格按照說明書操作。

1.2.4 血生化指標(biāo)和腸道組織細(xì)胞凋亡指數(shù)測定 每組取剩下的7只小鼠采取全血，方法與血漿的采取方法類似，從左心室取血成功后，立即進(jìn)行生化指標(biāo)[丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）]測定。處死小鼠取小腸組織，用10%甲醛固定6 h，石蠟包埋，制備5 μm厚切片，固定于玻片上。操作流程為制作石蠟切片，切片常規(guī)脫蠟，復(fù)水；后續(xù)過程在濕盒內(nèi)進(jìn)行，先用0.5%過氧化氫的磷酸鹽緩沖液（PBS）封閉內(nèi)源過氧化物酶活性，然后將切片在緩沖鹽溶液（SSC）中浸泡2次，每次20 min，水溫80℃，浸泡后用PBS洗2次；室溫下用1～2 μg/mL蛋白酶K的10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（pH=8.0）處理玻片10 min，再用PBS清洗3次；之后用補(bǔ)充有150 mmol/L氯化鈉的原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL）反應(yīng)緩沖液預(yù)孵育切片10 min；加TUNEL反應(yīng)液后，用熒光顯微鏡觀察并拍照。凋亡細(xì)胞核呈綠色熒光，即為TUNEL陽性細(xì)胞，正常細(xì)胞核無綠色熒光。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不重疊的視野，計(jì)算每張切片10個(gè)視野的總細(xì)胞數(shù)和總凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算每張切片的凋亡指數(shù)（10個(gè)視野的總凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比），DeadEndTM熒光測定TUNEL試劑盒購自美國Promega公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 四組小鼠行為學(xué)評(píng)分及腸道組織凋亡指數(shù)比較 與A組比較，C組和D組行為學(xué)評(píng)分升高，腸道組織凋亡指數(shù)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而B組上述指標(biāo)與A組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與C組比較，D組行為學(xué)評(píng)分和腸組織凋亡指數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 四組小鼠行為學(xué)評(píng)分及腸組織凋亡指數(shù)比較（±s）

表1 四組小鼠行為學(xué)評(píng)分及腸組織凋亡指數(shù)比較（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05；與C組比較，bP＜0.05。

組別n 行為學(xué)評(píng)分（分） 腸組織凋亡指數(shù)（%）A組B組C組D組7 7 7 7 0.20±0.40 0.20±0.40 9.00±0.60a4.70±2.40ab2.70±0.80 2.30±1.00 61.80±10.90a28.80±6.70ab

2.2 四組小鼠血生化指標(biāo)水平比較 與A組比較，C組和D組小鼠的ALT、AST、BUN、Cr水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B組上述各項(xiàng)指標(biāo)與A組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與C組比較，D組ALT、AST、BUN、Cr水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 四組小鼠血生化指標(biāo)水平比較（±s）

表2 四組小鼠血生化指標(biāo)水平比較（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05；與C組比較，bP＜0.05。

T（U/L） BUN（mmol/L）Cr（μmol/L）C組D組7 7 81.33±6.18a21.77±5.02ab3±11.24 7±8.69 336.17±13.80a104.15±15.52ab5.85±1.35 5.84±0.41 20.18±1.85a8.62±1.26ab30.90±4.39 30.93±3.55 90.77±7.60a40.28±7.46ab

2.3 四組小鼠血清與腸道組織MDA水平、CAT及SOD活力比較 與A組比較，C組和D組小鼠血清及腸組織MDA水平升高，SOD和CAT活力降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B組上述各指標(biāo)與A組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與C組比較，D組血清及腸組織MDA水平降低，SOD和CAT活力升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 四組小鼠血清與腸組織MDA、CAT及SOD水平比較（±s）

表3 四組小鼠血清與腸組織MDA、CAT及SOD水平比較（±s）

注：與A組比較，aP＜0.05，與C組比較，bP＜0.05。

組別n 血清MDA（nmol/mL） SOD（U/mL） CAT（U/mL）A組B組C組D組7 7 7 7 1.85±0.17 1.84±0.36 3.64±0.25a2.50±0.22ab91.67±8.98 93.33±4.04 72.15±4.47a87.01±4.66ab24.33±3.77 24.87±3.76 10.49±3.25a16.62±2.86ab組別n 腸組織MDA（nmol/mL） SOD（U/mL） CAT（U/mL）A組B組C組D組22.49±1.17 22.29±2.63 14.92±2.63a19.01±1.48ab7 7 7 7 2.98±0.18 2.92±0.24 4.61±0.32a3.13±0.23ab178.98±7.43 181.29±8.35 87.10±6.25a126.39±7.39ab

3 討 論

本研究通過CLP法制備小鼠膿毒癥模型觀察氫氣吸入對(duì)重度膿毒癥小鼠腸黏膜屏障功能、腸道組織氧化還原狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示，CLP后小鼠行為學(xué)評(píng)分降低，生化指標(biāo)出現(xiàn)異常，表明膿毒癥模型制備成功；CLP后腸道組織凋亡指數(shù)升高，提示膿毒癥誘發(fā)腸道損傷模型制備成功。

本課題組前期研究表明，CLP后1、6 h吸入2%氫氣1 h可提高膿毒癥小鼠生存率[14]，故本研究選擇CLP后1、6 h吸入2%氫氣1 h。結(jié)果表明，吸入氫氣后，膿毒癥小鼠行為學(xué)評(píng)分和相關(guān)血生化指標(biāo)降低，腸道凋亡指數(shù)降低，表明氫氣減輕了小鼠膿毒癥誘發(fā)的腸黏膜損傷。

有研究已經(jīng)證明，在膿毒癥的發(fā)展過程中，腸道是極易受累的器官[5-6]。受損的腸道組織通過促進(jìn)腸腔內(nèi)抗原、微生物和有害代謝產(chǎn)物向血循環(huán)中移位，在SIRS的發(fā)生中起著重要的推動(dòng)作用[7-8]，進(jìn)而產(chǎn)生了一種新的觀點(diǎn)——腸道是膿毒癥病程進(jìn)展的動(dòng)力器官[10]。因此，膿毒癥患者腸道功能的改變受到越來越多的重視，而腸黏膜屏障功能受損是膿毒癥患者最常見的腸道并發(fā)癥[11]。腸黏膜屏障功能失調(diào)可以促進(jìn)腸道菌群的異常增殖和細(xì)菌異位，導(dǎo)致二重感染和MODS的發(fā)生[12]。Doig等[15]在危重癥患者中開展的一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究證實(shí)，腸黏膜屏障功能缺陷與重癥患者M(jìn)ODS的發(fā)生及預(yù)后存在顯著相關(guān)性。腸黏膜屏障功能損傷的機(jī)制可能包括膿毒癥患者全身炎癥細(xì)胞的異常激活與促炎性細(xì)胞因子的大量釋放，氧自由基的大量產(chǎn)生可造成氧化應(yīng)激狀態(tài)[11]，這也是造成膿毒癥患者M(jìn)ODS、膿毒性休克甚至死亡的重要原因。

生理情況下，由于線粒體電子逸出或還原型輔酶Ⅱ、黃嘌呤氧化酶等氧化酶的作用，機(jī)體內(nèi)不斷產(chǎn)生具有生理活性的ROS，如超氧離子、過氧化氫等[16]，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能；并且能夠被SOD、CAT、谷胱甘肽等抗氧化酶類及時(shí)清除[17]。在膿毒癥的眾多發(fā)病機(jī)制中，氧自由基損傷扮演著重要角色。膿毒癥時(shí)可激活中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生大量的ROS。有害的ROS大量堆積，通過多種途徑對(duì)機(jī)體造成損傷，直接導(dǎo)致生物膜損傷和各種功能障礙，破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而加劇細(xì)胞凋亡活動(dòng)，導(dǎo)致DNA嚴(yán)重?fù)p傷，使DNA鏈發(fā)生難以修復(fù)的斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)通過測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平來反映機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，結(jié)果在膿毒癥模型組腸組織中發(fā)現(xiàn)MDA水平明顯增高，氫氣吸入后這種增高趨勢被抑制，說明腸道組織氧化損傷的存在，以及氫氣對(duì)有害自由基的選擇性清除作用[13]。而抗氧化酶（CAT、SOD等）可以減輕氧化應(yīng)激對(duì)組織、細(xì)胞及微結(jié)構(gòu)造成的損傷。從本實(shí)驗(yàn)不難看出，與假手術(shù)組相比，重度膿毒癥小鼠血清及腸組織中SOD和CAT活力顯著降低。

綜上所述，氫氣通過對(duì)ROS的選擇性清除、對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制，以及對(duì)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的激活，在膿毒癥腸道損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

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Protective effects of hydrogen on intestinal injury in septic mice*

Shi Yuan，Xie Keliang，Yu Yonghao，Wang Tao
（Department of Anesthesiology，General Hospital，Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China）

ObjectiveTo investigate the effect of hydrogen（H2）inhalation on the intestinal barrier function and intesti nal tissue redox status in severe septic mice and its mechanism.MethodsFifty-six male mice of the American Institute for Cancer Research（AICR）were selected，the body mass was 20-25 g and aged 5 weeks，and divided into four groups according to the random number table method：sham operation group（group A），sham operation+H2group（group B），sepsis group（group C）and sepsis+H2group（group D），14 cases in each group.The mouse sepsis model was produced by cecal ligation and puncture（CLP）method.The group B and D received 1 h inhalation of 2%H2at 1 and 6 h after CLP.The behavioral score was conducted at 24 h after CLP；the venous blood was collected for detecting blood biochemical indicators（ALT，AST，BUN，Cr），then the mice were sacrificed for taking the middle section of jejunum.The intestinal tissue was performed the TUNEL staining for observing the apoptosis situation of intestinal tissue cells and conducting the scoring；the levels of MDA and activity of CAT and SOD in blood and intesti nal tissue homogenate were detected.ResultsCompared with the group A，the behavioral score，intestinal tissue apoptosis index，levels of blood biochemical indicators（ALT，AST，BUN，Cr）and serum and intestinal tissue MDA level in the group C and D were increased，while the activityofSOD and CAT were decreased，the differences were statistically significant（P＜0.05），but which in the group B had no statistical differences as compared with the group A（P＞0.05）；compared with the group C，the behavioral score，intestinal tissue apoptosis index，levels of blood biochemical indicators and serum and intestinal tissue MDA level in the group D were decreased，while the activity of SOD and CAT were increased，the differences were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionH2inhalation has obviously protective effect on intestinal injury and intestinal mucosal barrier function destroy in severe septic mice，which may be associated with the anti-apoptotic effect and maintaining endogenous redox equilibrium state.

Sepsis； Intestinal mucosa； Hydrogen； Oxidative stress； Intestines； Apoptosis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.24.003

：A

：1009-5519（2016）24-3747-04

2016-09-13）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81071533，81101409）。

史媛（1986-），碩士研究生，主要從事臨床重癥醫(yī)學(xué)與麻醉學(xué)研究。