張明川，趙 剛，舒 暢，石 青

（重慶市銅梁區(qū)人民醫(yī)院：1.呼吸內(nèi)科；2.藥劑科402560）

掌葉半夏蛋白對肺癌細(xì)胞增殖的影響研究*

張明川1，趙 剛2，舒 暢1，石 青1

（重慶市銅梁區(qū)人民醫(yī)院：1.呼吸內(nèi)科；2.藥劑科402560）

目的觀察掌葉半夏蛋白對肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。方法將體外培養(yǎng)的對數(shù)生長期的人肺癌細(xì)胞株A549隨機(jī)分為空白對照組、掌葉半夏蛋白組（1.25、5.00、10.00 μg/mL）、陽性對照組（5.00 μg/mL順鉑）。利用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法測定各組細(xì)胞增殖相對抑制率；用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期；采用Western blotting測定B細(xì)胞淋巴瘤因子相關(guān)X蛋白（Bax）、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）含量。結(jié)果作用24 h后，掌葉半夏蛋白組與陽性對照組吸光度（OD）值均顯著低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且掌葉半夏蛋白組呈劑量依賴性；與空白對照組比較，掌葉半夏蛋白組與陽性對照組在G0～G1期人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞明顯增多，而S期人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且掌葉半夏蛋白組呈劑量依賴性；掌葉半夏蛋白組與陽性對照組人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中Bax表達(dá)水平均顯著高于空白對照組，而Bcl-2、Caspase-3表達(dá)水平及Bcl-2/ Bax顯著低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且掌葉半夏蛋白組呈劑量依賴性。結(jié)論掌葉半夏蛋白可調(diào)節(jié)人肺癌細(xì)胞株A549抗凋亡/促凋亡因子（Bcl-2/Bax）平衡，從而起到抑制細(xì)胞增殖的作用，且呈劑量依賴性。

肺腫瘤； 半夏； 植物蛋白質(zhì)類； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞周期

目前，臨床上對于早期肺癌患者常給予手術(shù)治療，但是根治者不足30%，而放療與化療在殺死癌癥細(xì)胞的同時會損傷正常細(xì)胞，不良反應(yīng)大[1]。中醫(yī)認(rèn)為，肺癌的病因包括邪毒留滯、情志勞倦、飲食內(nèi)傷等[2]，掌葉半夏，又名獨角蓮、獨腳蓮，味辛、性平，歸肺、肝、脾經(jīng)，具有燥濕化痰、散結(jié)消腫等功效。本研究通過觀察掌葉半夏蛋白對肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，探討其可能機(jī)制，為肺癌的治療提供方案，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料 注射用順鉑購自貴州漢方制藥有限公司（批號：140913）；掌葉半夏蛋白為自制[3]。人肺癌細(xì)胞株A549購自中美合資博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol購于美國Sigma公司。

MinicylerTMPCT-150PCR反應(yīng)儀購于美國MJ RE-SEARCH公司，HL-2920P酶標(biāo)自動分析儀、蛋白質(zhì)電泳和轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購于美國伯樂公司，Du-7HS型紫外分光光度計購自美國貝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1 人肺癌細(xì)胞株A549培養(yǎng) 在37℃、5%CO2環(huán)境下，用含10%胎牛血清、100 μg/L鏈霉素及100 μg/L青霉素的DMEM培養(yǎng)基對人肺癌細(xì)胞株A549進(jìn)行培養(yǎng)，高倍顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)狀態(tài)良好時（對數(shù)生長期）接種到培養(yǎng)板培養(yǎng)。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法檢測細(xì)胞增殖相對抑制率 將對數(shù)生長期的人肺癌細(xì)胞株A549分為五組，Ⅰ組為空白對照組[不加藥，加入同等體積二甲基亞砜（DMSO）]；Ⅱ～Ⅳ組為掌葉半夏蛋白組，分別加入不同濃度掌葉半夏提取物（1.25、5.00、10.0 μg/mL）；Ⅴ組作為陽性對照組（5.00 μg/mL順鉑），繼續(xù)培養(yǎng)，分別于12、24、48 h后，加入1 mg/mL的MTT工作液，每孔500 μL，在570nm波長下檢測吸光度（OD）值，分析測定掌葉半夏對人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞增殖相對抑制率。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 將對數(shù)生長期的人肺癌細(xì)胞株A549分為五組，Ⅰ組為空白對照組（不加藥，加入同等體積DMSO，Ⅱ～Ⅳ組分別加入不同濃度掌葉半夏提取物（1.25、5.00、10.0 μg/mL），V組作為陽性對照組（加入5.00 μg/mL順鉑），繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，加入50 μg/mL的碘化丙啶進(jìn)行染色，每孔500 μL，用流式細(xì)胞儀檢測，分析細(xì)胞周期。

1.2.4 Western blotting測定 Bax、Bcl-2、Caspase-3含量 在培養(yǎng)板中加入Trizol緩沖液1 mL裂解脂肪細(xì)胞5 min，然后4℃16 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC水進(jìn)行總RNA提取。使用RNA凝膠電泳檢測RNA并進(jìn)行定量。在42℃環(huán)境下加入Oligo和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第1鏈。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增特異性cDNA。B細(xì)胞淋巴瘤因子相關(guān)X蛋白（Bax）cDNA序列上游引物（5′～3′）：CTTTGCCAGCAAACTGGTGC，下游引物（5′～3′）：GAGTCTCACCCAACCACCCT；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bal-2）cDNA序列上游引物（5′～3′）：CCCTGTGGATGACTGAGTACC，下游引物（5′～3′）：GCCGTACAGTTCCACAAAGG。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）序列上游引物（5′-3′）：GTGAGGCGGTTGTAGAAGAGTT，下游引物（5′-3′）：TCACGGCCTGGGATTTCAAG。PCR擴(kuò)增后以2%瓊脂糖凝膠電泳，CFX-96數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)拍照進(jìn)行定量分析。用ECL顯色（南京金斯瑞生物有限公司），β-actin作為對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析或不配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 掌葉半夏蛋白對人肺癌細(xì)胞株A549增殖的抑制作用 作用24h后，掌葉半夏蛋白組與陽性對照組OD值均顯著低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并且掌葉半夏蛋白組呈現(xiàn)劑量依賴性：1.25 μg/mL掌葉半夏蛋白組的OD值高于陽性對照組，而10.00 μg/mL掌葉半夏蛋白組的OD值低于陽性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但5.00μg/mL掌葉半夏蛋白組OD值與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 掌葉半夏蛋白對人肺癌細(xì)胞株A549增殖的抑制作用[±s，lg（1/trans）]

表1 掌葉半夏蛋白對人肺癌細(xì)胞株A549增殖的抑制作用[±s，lg（1/trans）]

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與陽性對照組比較，bP＜0.05。

組別OD值12 h 24 h 48 h空白對照組掌葉半夏蛋白組1.25 μg/mL 5.00 μg/mL 10.00 μg/mL陽性對照組1.23±0.070.87±0.031.02±0.03 0.79±0.04ab0.53±0.04a0.36±0.02ab0.50±0.05a1.17±0.03 1.12±0.05 1.06±0.04 1.10±0.05 0.64±0.02ab0.42±0.06a0.18±0.03ab0.39±0.04a

2.2 掌葉半夏蛋白對人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞周期的影響 與空白對照組比較，掌葉半夏蛋白組與陽性對照組在G0～G1期人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞明顯增多，S期人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但在G2～M期差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；掌葉半夏蛋白組呈現(xiàn)劑量依賴性：1.25 μg/mL掌葉半夏蛋白組人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞在G0～G1期少于陽性對照組，在S期多于陽性對照組，而10.00 μg/mL掌葉半夏蛋白組人肺癌細(xì)胞在G0～G1期多于陽性對照組，在S期少于陽性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但5.00 μg/mL掌葉半夏蛋白組人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞在G0～G1與S期與陽性對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 掌葉半夏蛋白對人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞周期的影響[±s，lg（1/trans）]

表2 掌葉半夏蛋白對人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞周期的影響[±s，lg（1/trans）]

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與陽性對照組比較，bP＜0.05。

組別G0～G1 G2～M S空白對照組掌葉半夏蛋白組1.25 μg/mL 5.00 μg/mL 10.00 μg/mL陽性對照組52.10±3.8216.20±1.9830.50±2.43 57.80±4.15ab62.50±4.47a69.80±4.29ab61.80±4.30a16.40±1.15 15.30±0.76 14.90±0.68 15.20±0.82 26.90±2.06ab24.30±1.45a20.90±1.02ab23.50±1.61a

2.3 掌葉半夏蛋白對人肺癌細(xì)胞株A549中Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響 掌葉半夏蛋白組與陽性對照組人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中Bax表達(dá)水平顯著高于空白對照組，而Bcl-2、Caspase-3表達(dá)水平及Bcl-2/Bax均顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；掌葉半夏蛋白組呈劑量依賴性：1.25 μg/mL掌葉半夏蛋白組Bax表達(dá)水平低于陽性對照組，Bcl-2、Caspase-3表達(dá)水平及Bcl-2/Bax高于陽性對照組，而10.00 μg/mL掌葉半夏蛋白組Bax表達(dá)水平高于陽性對照組，Bcl-2、Caspase-3表達(dá)水平及Bcl-2/Bax低于陽性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但5.00 μg/mL半夏蛋白組上述指標(biāo)與陽性對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 掌葉半夏蛋白對人肺癌細(xì)胞株A549中Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響[±s，lg（1/trans）]

表3 掌葉半夏蛋白對人肺癌細(xì)胞株A549中Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響[±s，lg（1/trans）]

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與陽性對照組比較，bP＜0.05。

組別Bax Bcl-2 Bcl-2/Bax Caspase-3空白對照組掌葉半夏蛋白組1.25 μg/mL 5.00 μg/mL 10.00 μg/mL陽性對照組162.00±10.90129.00±12.303.65±0.230.80±0.11 181.00±13.70ab189.00±14.90a194.00±16.50ab191.00±15.20a123.00±9.84ab109.00±7.49a101.00±8.01ab108.00±7.25a2.48±0.19ab1.95±0.18a1.73±0.15ab1.86±0.20a0.68±0.09ab0.57±0.10a0.49±0.08ab0.56±0.11a

3 討 論

肺癌是由多基因損傷變異、不良生活習(xí)慣、職業(yè)暴露（砷、鎳、煤焦油等）、空氣污染等多種因素導(dǎo)致的、發(fā)生于支氣管黏膜上皮的肺原發(fā)性惡性腫瘤，流行病學(xué)調(diào)查顯示，肺癌在我國人群中的發(fā)病率為48/10萬～53/10萬，2013年因肺癌死亡人數(shù)居惡性腫瘤首位[4]。對于肺癌患者西醫(yī)主要采用手術(shù)切除病灶（早、中期肺癌）或放療與化療抑制癌細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移達(dá)到治療肺癌的目的。但有研究表明，手術(shù)、放療和化療等西醫(yī)治療方法在清除、縮小腫瘤細(xì)胞的同時，也會對機(jī)體免疫系統(tǒng)造成影響，患者常因免疫功能損害而中斷治療[5]。隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，中藥由于療效確切、不良反應(yīng)小等優(yōu)點被逐漸應(yīng)用于臨床疾病治療。中醫(yī)認(rèn)為，肺癌歸屬于“咯血”、“肺巖”、“胸痛”等范疇，將中藥用于肺癌治療[6-7]，可以通過抑制肺癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化凋亡及完善免疫功能、加速體力恢復(fù)2個方面發(fā)揮治療效果。掌葉半夏為天南星科植物掌葉半夏Rhizoma Pinelliae Pedatiseatae的干燥塊莖，大量研究證實，掌葉半夏提取物能夠調(diào)控宮頸癌細(xì)胞株HPVE6基因、p53基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，且具有抗腫瘤、免疫作用[8-10]，掌葉半夏屬于在肺癌治療中使用頻率最高的化痰藥范疇，但是臨床上對于其在對肺癌細(xì)胞的作用鮮有報道。

本研究選取人肺癌細(xì)胞株A549作為研究對象，觀察掌葉半夏蛋白對肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用，發(fā)現(xiàn)掌葉半夏蛋白作用24 h后對人肺癌細(xì)胞株A549增殖的抑制作用最佳，能夠顯著抑制細(xì)胞增殖，且呈現(xiàn)劑量依賴性。此外，本研究發(fā)現(xiàn)掌葉半夏蛋白組與陽性對照組在G0～G1期人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞明顯增多，而S期人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示掌葉半夏蛋白能夠使細(xì)胞增殖速度減慢。有研究表明，Bcl-2基因家族、Her2/neu基因、MYC基因在肺癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用，其中促凋亡的Bax與抗凋亡的Bcl-2是Bcl-2基因家族的重要成員，Bax/Bcl-2比值與癌癥細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，而Caspase-3被稱為“死亡蛋白酶”，在凋亡信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。本研究中掌葉半夏蛋白組與陽性對照組人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞中Bax表達(dá)量顯著高于空白對照組，而Bcl-2、Caspase-3表達(dá)量及Bcl-2/Bax顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且掌葉半夏蛋白組呈劑量依賴性，提示掌葉半夏通過調(diào)控Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤作用。但是，掌葉半夏中的凝集素蛋白及毒針晶具有毒性[11-12]，會對正常細(xì)胞造成損傷。本研究僅針對腫瘤細(xì)胞抑制作用進(jìn)行分析，未對正常細(xì)胞損害進(jìn)行探討，臨床上應(yīng)進(jìn)行深入研究以提高其使用價值。

綜上所述，掌葉半夏蛋白通過調(diào)控Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。

[1]Zhou J，Zhao WY，Ma X，et al.The anticancer efficacy of paclitaxel liposomes modified with mitochondrial targeting conjugate in resistant lung cancer[J].Biomaterials，2013，34（14）：3626-3638.

[2]楊凱，楊磊.中醫(yī)在中西醫(yī)結(jié)合治療晚期非小細(xì)胞肺癌中的作用及研究現(xiàn)狀[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2013，11（11）：157-158.

[3]孫光星，丁聲頌.掌葉半夏總蛋白的提取，化學(xué)分析和對小鼠S-180瘤株的抑制作用[J].復(fù)旦學(xué)報：醫(yī)學(xué)報，1992，19（1）：17-20.

[4]姚曉軍，劉倫旭.肺癌的流行病學(xué)及治療現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，22（8）：1982-1986.

[5]朱麗華，李和根，史美育，等.非小細(xì)胞肺癌根治術(shù)后無瘤生存期影響因素分析及中藥干預(yù)效果評價[J].上海中醫(yī)藥雜志，2013，47（2）：11-15.

[6]蔡凱，劉俊波，黃常江，等.益氣養(yǎng)陰中藥對三維適形放療局部晚期非小細(xì)胞肺癌老年患者生活質(zhì)量及免疫功能的影響[J].西部中醫(yī)藥，2012，25（11）：1-4.

[7]沈晨君.中藥治療肺癌用藥規(guī)律分析[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，35（2）：127-129.

[8]李桂玲，夏晴，陳松華，等.掌葉半夏提取物的有效部位對宮頸癌細(xì)胞株HPVE6和P53基因表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（1）：110-113.

[9]黃海霞，張明星，張萌，等.掌葉半夏提取物對宮頸癌荷瘤小鼠脾臟免疫的作用[J].復(fù)旦學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2016，43（5）：534-542.

[10]李桂玲，歸綏琪，夏晴，等.掌葉半夏有效提取物對宮頸癌細(xì)胞株增殖的抑制作用[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2010，19（1）：53-57.

[11]郁紅禮，張倩，吳皓，等.掌葉半夏（虎掌南星）礬制前后致炎毒性比較研究[J].中國中藥雜志，2013，38（22）：3893-3897.

[12]金羊平，吳皓，郁紅禮，等.姜辣素拮抗掌葉半夏毒針晶刺激性毒性的機(jī)制研究[J].中國中藥雜志，2016，41（6）：1087-1092.

Study on effect of Pinellia pedatisecta Schott protein on proliferation of lung cancer cells*

Zhang Mingchuan1，Zhao Gang2，Shu Chang1，Shi Qing1
（1.Department of Respiration；2.Department of Pharmacy，Tongliang District People′s Hospital of Chongqing 402560，China）

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of Pinellia pedatisecta Schott protein on the proliferation of lung cancer cells.MethodsCultured human lung cancer cell line A549 in vitro at logarithmic growth phase were randomly divided into the blank control group，Pinellia pedatisecta Schott protein groups（1.25，5.00，10.00 g/mL）and positive control group（cisplatin 5.00 g/mL）.The relative inhibition rate of cell proliferation in each group was measured by MTT colorimetric method；the cell cycle was detected by flow cytometry；the contents of Caspase-3，Bcl-2 and Bax were determined by Western blotting.ResultsThe optical density（OD）value after 24 h action in the Pinellia pedatisecta Schott protein group and positive control group was significantly lower than that in the blank control group，the difference was statistically significant（P＜0.05），moreover the Pinellia pedatisecta Schott protein group showed a dose-dependent manner;compared with the blank control group，human lung cancer cell line A549 cells at stage G0～G1in the Pinellia pedatisecta Schott protein group and positive control group were significantly increased，while which at the stage S were significantly decreased，the differences were statistically significant（P＜0.05），moreover the Pinellia pedatisecta Schott protein group showed a dose-dependent manner；the Bax expression level of human lung cancer cell line A549 cells in the Pinellia pedatisecta Schott protein group and positive control group was significantly higher than that in the blank control group，while Bcl-2 and Caspase-3expression levels and Bcl-2/Bax were significantly lower than those in the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05），moreover the Pinellia pediatisecta Schott protein group showed a dosedependent manner.ConclusionPinellia pedatisecta Schott protein can regulate the anti-apoptosis/pro-apoptosis factors（Bcl-2/ Bax）balance of human lung cancer cell line A549，thus plays the effect for inhibiting the cellular proliferation，moreover with a dose-dependent manner.

Lung neoplasms； Pinellia ternate； Plant proteins； Cell proliferation； Cell cycle

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.24.007

：A

：1009-5519（2016）24-3760-03

2016-11-15）

重慶市銅梁區(qū)科委2014年醫(yī)療衛(wèi)生類社會事業(yè)科技資助項目（201405）。

張明川（1977-），碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事肺癌早期診斷及慢性氣道炎癥性疾病的防治研究。