吳偉懷等

摘 要 下載Aspergillus niger ATCC 1015菌株全基因組序列，利用GRAMENE網(wǎng)站提供的SSR鑒定工具SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool），并按含有2～10個堿基重復、堿基數(shù)在18 bp以上的SSR基元為標準進行SSR鑒定。結果從A. niger ATCC 1015全基因組中，共發(fā)現(xiàn)4 000個2～10堿基SSR，其中含9個堿基重復基元類型最多，共有1 433個，占所鑒定SSR總數(shù)的35.8%。其次為6個堿基重復基元類型，共有753個，占SSR總數(shù)的18.8%；接著為3個堿基重復類型，共有547個，占13.6%。從鑒定出來的SSR中，選擇含有SSR的合適區(qū)段，從中設計了36對引物，對劍麻莖腐病菌17個菌株的基因組DNA進行了PCR檢測，發(fā)現(xiàn)這些引物都能從劍麻莖腐病菌基因組DNA中有效擴增。由此表明，黑曲霉ATCC 1015菌株基因組SSR在劍麻莖腐病菌基因組中具有通用性。這為研究劍麻莖腐病菌群體遺傳變異、多樣性和進化，定位和克隆功能基因等提供了分子標記。

關鍵詞 黑曲霉；劍麻；SSR標記

中圖分類號 Q78；S432.4 文獻標識碼 A

Development of Genomic SSR Markers for

Aspergillus niger from Sisal

WU Weihuai1， HE Chunping1 *， YAN Chuandi2， ZHENG Jinlong1

LI Rui1， ZHENG Xiaolan1， LIU Qiaolian3， YI Kexian1 *

1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory for Monitoring and Control of

Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests / Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical

Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

2 College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

3 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，CATAS，Haikou，Hainan 571101

Abstract Simple sequence repeat identification tool was used to screen SSRs in complete genome sequence of Aspergillus niger ATCC 1015. Suitable sequence regions harboring SSR were selected for primers design using Primer5.0 software， and synthesized primers were used to amplify genomic DNA of selected 17 isolates of A. niger from sisal. A total of 4 000 SSRs were found in A. niger ATCC 1015. Of the 4 000 SSRs， the most abundant SSR was the non-nucleotide type， with the SSR numbers being 1 433， followed by the hexa- and tri- nucleotide ones， being 753 and 547， respectively. A set of 36 SSR markers were developed from the genomic sequence of the reference isolate A. niger ATCC 1015. These markers were amplified successfully from the genomic DNAs of A. niger from sisal. Therefore， the markers are useful to analyses genetic mutation， diversity and， evolution of sisal A. niger， and also useful for gene mapping and cloning in the pathogens.

Key words Aspergillus niger； Sisal； Simple sequence repeat（SSR）

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.024

利用分子標記技術從基因組水平了解病原真菌變異及其遺傳多樣性對于防治植物病原真菌有著重要意義。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，許多分子標記如RAPD、SRAP、AFLP、SSR等已廣泛用于病原菌群體遺傳變異與遺傳多樣性分析。在此類標記當中，SSR標記又由于其具有在基因組中分布廣，側翼序列相對保守，多態(tài)性好，標記多呈共現(xiàn)性，操作簡單，重復性好等諸多優(yōu)點而普遍受到歡迎。該標記已成為病原菌群體遺傳結構、群體進化、遺傳多樣性，分子發(fā)育等研究的重要工具[1-3]。目前的研究結果表明，從原核生物到人類基因組均含有豐富而高度多態(tài)性的SSR[4]。近年來，隨著生物基因組的大規(guī)模測序的開展，GenBank中已存貯了大量不同生物類型的基因組DNA序列，這為SSR標記開發(fā)提供了豐富的DNA序列來源。

黑曲霉是一種廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中的曲霉屬真菌，是一類重要的致病真菌，同時也是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種。目前該菌已有產(chǎn)酶菌株CBS 513.88和產(chǎn)檸檬酸菌株ATCC 1015等2個工業(yè)菌株分別獲得了全基因組序列，前者于2007年完成測序[5]，而后者于2011年完成測序[6]。比較而言，后者基因組序列更加完善[6]。

由黑曲霉菌（Aspergillus niger Van. Teigh）引起的莖腐病是劍麻最嚴重的病害之一[7-9]。上世紀80年代，該病曾在我國粵西地區(qū)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[10]。近年來，該病在我國劍麻主產(chǎn)區(qū)呈現(xiàn)愈來愈加重之勢。為此，本研究擬利用ATCC 1015全基因組序列，首先對其進行全基因組SSR搜索，尋找并開發(fā)合適的SSR標記，并用于劍麻莖腐病菌基因組DNA擴增，以期為該病原菌群體進化和遺傳多樣性分析，致病相關基因等的精細定位研究等提供理想的分析工具。

1 材料與方法

1.1 材料

從（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）網(wǎng)站下載A. niger ATCC 1015菌株全基因組序列（ACJE

00000000）。

1.1.1 供試菌株 用于本研究的17個劍麻莖腐病菌株其具體信息詳見表1。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉全基因組SSR位點篩選 利用GRAMENE網(wǎng)站（http：//www.gramene.org/db/markers/ssrtool）提供的SSR鑒定工具SSRIT（Simple Sequence Repeat Identification Tool）進行SSR鑒定。SSR鑒定標準為含有2～10個堿基重復、堿基數(shù)在18 bp 以上的SSR 基元，也即含2、3、4、5、6、7、8、9和10核苷酸基元SSR的最小重復數(shù)分別為9、6、5、4、3、3、3、2和2次。

1.2.2 引物設計 對鑒定出的各SSR進行比較，選取含有堿基數(shù)較大的SSR的核苷酸序列，在其基元上下游合適的位置，用軟件primer5.0設計引物。引物一般要求GC含量40%～65%，Tm值55～65 ℃，引物序列長18～25 bp，且無錯配、不形成二聚體和發(fā)夾結構等。設計好的引物最終由Invitrogen公司合成。

1.2.3 引物的有效性評價 引物的有效性通過對收集于我國不同劍麻栽培區(qū)的17個菌株進行評價。標記開發(fā)成功的標準即為：供篩選的引物只要在17個劍麻莖腐病菌株中的任一個中擴增出有效條帶即為有效引物，而在17個菌株中擴增出不同DNA大小片段的則記為多態(tài)性標記。

1.2.4 劍麻莖腐病菌株及DNA提取 各參試菌株的總DNA采用DNA提取試劑盒（E.Z.N.A Fungal DNA kit，Omega公司，美國）提取。

1.2.5 PCR擴增及產(chǎn)物檢測 PCR反應體系為20 μL，含有20～30 ng DNA模板，10 μL 2×Eco Taq PCR Super Mix，上下游引物各0.5 μL（10.0 μmol/L），ddH2O補齊。PCR反應在Mastercycler gradient Mastercycler PCR擴增儀上進行，擴增程序為：94 ℃預變性3 min；隨后94 ℃變性30 s，55～60℃退火30 s（根據(jù)所用引物的Tm值確定退火溫度），72 ℃延伸30 s，擴增35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min，10 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外燈下檢測和照相。

1.2.6 克隆與測序 回收PCR產(chǎn)物并與pEASYTM Cloning Vector連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選后，選取陽性克隆子送Invitrogen公司測序。獲得的序列經(jīng)人工去除載體序列后，利用多序列比對軟件工具（http：//multalin.toulouse.inra.fr/multalin/），將所獲得的序列與參考菌株A. niger ATCC 1015對應序列進行比對。

2 結果與分析

2.1 黑曲霉菌基因組SSR查詢分析

利用SSRIT軟件對A. niger ATCC 1015菌株全基因組進行SSR搜索，結果共發(fā)現(xiàn)4 000個SSR（表2）。在這4 000個SSR中，其中9個堿基重復基元類型最多，共有1 433個，占所鑒定SSR總數(shù)的35.8%；其次為6個堿基重復基元類型，共有753個，占SSR總數(shù)的18.8%；接著為3個堿基重復類型，共有547個，占13.6%。而數(shù)量較少的則為7與8堿基類型，二者分別為85與68個；接著為5、2、4堿基基元類型，分別為194、282及286個（表2）。

2.2 SSR篩選與引物設計

由于SSR多態(tài)性密切相關其基元重復數(shù)[11]，而且重復數(shù)越高，其變異概率越大[12-13]。為此，通過對已鑒定的4 000個SSR進一步進行比較分析，從中篩選出堿基基元數(shù)與重復數(shù)乘積數(shù)較大的SSR （重復類型的總核苷酸數(shù)較大的SSR），并在其上下游設計引物。最終，從篩選出來的SSR中共設計了36對SSR引物，36對SSR引物分布于24個測序支架中的17個（表3）。

2.3 引物有效性檢測

為了檢測已設計的36對SSR引物在劍麻莖腐病菌中的存在情況。分別對17個劍麻莖腐病菌DNA進行了PCR擴增。結果表明，所設計的36對引物均能在劍麻莖腐病菌基因組DNA中有效擴增（圖1）。其中具有多態(tài)性的19對引物均能擴增出2個及以上的等位基因，占總引物數(shù)的52.7%。如引物AN5-1擴增的條帶中既有大小的差異，也有存在與缺失（有或無條帶）的多態(tài)（圖1-B）；引物An8-1擴增出來的條帶中存在明顯的大小差異（圖1-C）；而引物AN21-1在17個供試菌株中均能擴增出唯一條帶（圖1-F）；由引物An14-1及引物An17-1等擴增出來的條帶中存在明顯的條帶大小差異多態(tài)性（1-D，1-E）。故基于A. niger ATCC 1015菌株序列所開發(fā)劍麻莖腐病菌同源SSR標記是可行的。

2.4 莖腐病菌SSR的PCR產(chǎn)物序列分析

為了進一步驗證所開發(fā)的SSR標記的真實性，選取An5-1引物并對CH0002、CH0008、CH0009菌株DNA進行擴增，進而對其擴增產(chǎn)物進行克隆與測序。將獲得的序列與A. niger ATCC 1015菌株對應序列進行比對。序列分析結果表明，與參考菌株A. niger ATCC 1015中（act）22 基元相比，在CH0002、CH0008、CH0009菌株中則均缺失了一個（act）10基元（圖2）。由此表明，該處SSR的位點是真實存在的。除此之外，3個菌株其序列在SSR基元區(qū)中還存在6個核苷酸變異，這就表明，劍麻莖腐病病原菌與A. niger ATCC 1015菌株間存在一定的差異。另一方面，就CH0002、CH0008、CH0009菌株序列而言，在該處SSR位點沒有差異，但在其側翼序列存在一個（GCT）3的差異。盡管如此，莖腐病菌與A. niger ATCC 1015序列仍然擁有非常高的同源性。由此表明，根據(jù)其開發(fā)的SSR在劍麻莖腐病菌中具有真實性和通用性。

3 討論

隨著生物技術的不斷發(fā)展，尤其是高通量測序技術的出現(xiàn)，越來越多的生物基因組被破譯。如何充分利用這些基因組的序列信息是后基因組時代的重要課題。而從這些已知基因組中查詢核苷酸序列已成為快速、有效開發(fā)SSR標記的途徑。目前，已有2個黑曲霉菌株進行了全基因組測序，這為從黑曲霉基因組中開發(fā)劍麻莖腐病SSR標記提供了可能。本研究利用黑曲霉ATCC 1015菌株基因組為參考序列，從中共鑒定到4 000個2～10堿基SSR，進而選擇重復次數(shù)比較多的36個位點設計引物，通過17個劍麻莖腐病菌基因組DNA檢測發(fā)現(xiàn)，36對引物均能從供試菌株中有效擴增。其中19對引物具有多態(tài)性，占總引物數(shù)的52.7%。由此，一方面說明利用該基因組來開發(fā)劍麻莖腐病菌基因組SSR具有可行性，另一方面也說明該方法具有高效性。進一步的測序驗證了參考菌株序列與劍麻莖腐病菌具有高度的同源性。這為將來開發(fā)更多具有多態(tài)性的SSR分子標記提供了可能。

在本研究所鑒定出的SSR中，其中含9個堿基重復基元類型最多，共有1 433個，占所鑒定SSR總數(shù)的35.8%。其次為6個堿基重復基元類型，共有753個，占SSR總數(shù)的18.8%；接著為3個堿基重復類型，共有547個，占13.6%。比較而言，在稻瘟病菌基因組中最豐富的是單堿基基元重復類型，其次為三堿基基元重復類型，以及五堿基重復核苷酸基元類型，數(shù)量最少的則是二核苷酸堿基類型[14]。在粗糙脈孢菌基因組中，其中數(shù)量最多的是三堿基SSR，數(shù)量達到4 729個，其次為六堿基SSR （2 940個）和單堿基SSR（2 489個）；而數(shù)量最少的是二堿基SSR[15]。然而，在構巢曲霉菌基因組中，最豐富的類型為五核苷酸基元類型，其次為六堿基以及三堿基類型，而最少的類型則是二核苷酸重復類型[16]。與之相似的，本研究中發(fā)現(xiàn)二堿基SSR也是屬于比較少的。由此表明，不同病原菌基因組中SSR類型存在明顯差異，但也可能與鑒定SSR時所設定的標準不同有一定的關系[17]。

迄今為止，雖然已在稻瘟病菌、粗糙脈孢菌、構巢曲霉菌以及禾谷鐮刀菌等多種病原菌中開發(fā)出了SSR標記[14-15，17]，但是據(jù)筆者所了解，對劍麻莖腐病菌進行SSR標記開發(fā)，尚屬首次。這為研究劍麻莖腐病菌遺傳變異、遺傳多樣性、進化以及功能基因的定位和克隆等提供了有效的分子標記。

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