黎舒懷等

摘 要 以鄰苯二胺為功能單體，伏草隆為模板分子，在金電極表面通過(guò)電聚合的方法制備對(duì)伏草隆具有特異識(shí)別能力的分子印跡膜，利用門(mén)效應(yīng)原理對(duì)伏草隆進(jìn)行測(cè)定。采用電化學(xué)手段對(duì)分子印跡膜進(jìn)行表征，對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化并且考察傳感器的抗干擾能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：傳感器對(duì)伏草隆具有很好的特異識(shí)別能力，在試驗(yàn)的最優(yōu)條件下，伏草隆濃度在5×10-9～2×10-7 mol/L范圍內(nèi)與電流的響應(yīng)信號(hào)呈良好的線性關(guān)系；方法的檢出限達(dá)到1.7×10-9 mol/L。該傳感器應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，加標(biāo)回收率為103.0%～105.6%，結(jié)果令人滿意。

關(guān)鍵詞 分子印跡；電流型傳感器；門(mén)效應(yīng)；伏草隆

中圖分類號(hào) TP212 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

An Amperometric Sensor Based on Molecularly Imprinted Membrane for Detecting Fluometuron Residual

LI Shuhuai， WAN Yao， XU Zhi， YIN Guihao

Analysis and Test Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Provincial key

Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Haikou， Hainan 571101

Abstract A sensitive molecularly imprinted electrochemical sensor based on gate-controlled effect was prepared with o-phenylenediamine as functional monomer for the detection of fluometuron. The performance of molecularly imprinted polymer and the electrochemical behavior in molecular imprinted sensor were investigated， the assay conditions and interference factors were tested. The sensor exhibited good selectivity to fluometuron， the decrease of current intensities was linear to the concentrations of fluometuron under the optimal conditions. The detection range was 5×10-9 to 2×10-7 mol/L， with a detection limit of 1.7×10-9 mol/L. When the sensor was used in the determination of real samples， the recoveries could reach 103.0%-105.6%.

Key words Molecularly imprinted；Amperometric sensor；Gate-controlled effect；Fluometuron

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.033

伏草?。╢luometuron）是一類內(nèi)吸選擇性土壤處理使用除草劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛[1]。有研究表明，該除草劑在水體、土壤和農(nóng)作物中會(huì)產(chǎn)生較難降解的殘留，并對(duì)人畜造成一定的危害。因此，有必要對(duì)伏草隆殘留進(jìn)行有效的監(jiān)測(cè)。目前檢測(cè)伏草隆的方法主要有酶聯(lián)免疫法[2-3]，高效液相色譜法及與其他技術(shù)的聯(lián)用方法等[4-5]，但是這些方法成本較高，分析較繁瑣。因此，有必要尋找更加靈敏、簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)伏草隆的新方法。

分子印跡技術(shù)（molecularly imprinted technique，MIT），也被稱為“分子烙印技術(shù)”，是一種新興的分子識(shí)別分離技術(shù)，其核心是合成分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）[6]。MIP具有與模板分子在結(jié)構(gòu)相匹配的印跡孔穴，這些孔穴通過(guò)特異性結(jié)合位點(diǎn)能夠選擇性地與模板分子重新發(fā)生結(jié)合。由于MIP具有抗惡劣條件（如高溫、高壓，酸堿）的優(yōu)勢(shì)，因此被廣泛作為電化學(xué)傳感器的敏感材料，用于制備分子印跡電化學(xué)傳感器[7-9]。常見(jiàn)的分子印跡電化學(xué)傳感器[10-11]通常是根據(jù)所測(cè)物質(zhì)自身在分子印跡膜修飾電極上的電化學(xué)行為來(lái)對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定，因印跡孔穴數(shù)量有限，靈敏度的提高受到限制。此外，這些傳感器在沒(méi)有電活性的物質(zhì)的檢測(cè)中也受到了很大的限制。盡管有報(bào)道利用放大效應(yīng)的傳感器來(lái)間接測(cè)定非電活性物質(zhì)[12-13]，但是這些方法的分析過(guò)程繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于推廣使用。因此，更加簡(jiǎn)單的“門(mén)效應(yīng)”技術(shù)得到更多的關(guān)注。所謂“門(mén)效應(yīng)”是指分子印跡膜上的模板分子洗脫后，探針通過(guò)印跡膜上的孔穴，在電極表面發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，從而產(chǎn)生電流響應(yīng)，最終達(dá)到間接檢測(cè)的目的[14-15]。結(jié)合“門(mén)效應(yīng)”的分子印跡傳感器具有方法簡(jiǎn)單，靈敏度高，選擇好等優(yōu)點(diǎn)，但是在檢測(cè)伏草隆殘留方面未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究以鄰苯二胺為功能單體，伏草隆為模板分子，在金電極表面利用電聚合方法制備得到性能穩(wěn)定的伏草隆分子印跡傳感器。通過(guò)洗脫模板分子后，得到保留有對(duì)伏草隆分子特異性識(shí)別的印跡孔穴。以模板分子的洗脫與重吸附作為控制鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀探針進(jìn)入印跡孔穴的開(kāi)關(guān)，根據(jù)抵達(dá)電極表面的探針?lè)肿拥牧康牟煌瑥亩a(chǎn)生不同的電流響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)間接測(cè)定模板分子的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

伏草隆、異丙隆、綠麥隆、異丙威和敵草隆標(biāo)準(zhǔn)品（>99.0%）均購(gòu)自成都貝斯特化學(xué)有限公司，使用時(shí)用二次水配制成相應(yīng)的濃度；鄰苯二胺購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；含0.5 mol/L氯化鉀的3×10-4 mol/L鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀溶液（K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]）；試驗(yàn)用水為二次水。所有測(cè)定均在室溫條件下（25 ℃）進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 分子印跡傳感器的制備 金電極在使用之前，分別使用1.0、0.3、0.05 μm Al2O3粉末研磨，拋光電極表面，然后分別置于二次水、乙醇、50%的硝酸中超聲清洗，晾干后備用。處理好的電極置于0.04 mol/L的醋酸緩沖液中（pH=5.0，含3×10-4 mol/L的鄰苯二胺和1×10-4 mol/L的伏草?。?，用循環(huán)伏安法進(jìn)行電聚合。掃描范圍為0～0.8 V，掃速選50 mV/s，掃描圈數(shù)為25圈。聚合完成后，用50%的乙酸溶液洗脫電極，除去模板分子，即得到保留有模板分子印跡孔穴的MIP修飾電極。同樣的方法制備非分子印跡膜，只是在聚合的過(guò)程中不加入模板分子伏草隆。檢測(cè)時(shí)，將修飾電極置于樣品溶液中重吸附6 min，檢測(cè)相應(yīng)的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。試驗(yàn)過(guò)程如圖1所示。

1.2.2 檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)采用循環(huán)伏安法（CV）、交流阻抗法（AC）和差分脈沖伏安法（DPV）對(duì)分子印跡傳感器進(jìn)行表征和檢測(cè)。CV的掃描范圍為-0.2～0.6 V，掃描速率為0.1 V/s；AC頻率范圍是100 mHz～100 kHz，振幅為5 mV；DPV掃描范圍為0.6～-0.2 V，振幅為50 mV。

1.2.3 樣品處理 準(zhǔn)確吸取來(lái)自不同稻田的水樣100 mL，靜置過(guò)夜后，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入5 g氯化鈉，再分別使用50 mL和40 mL二氯甲烷萃取2次，提取液合并后經(jīng)無(wú)水硫酸鈉吸附過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)移到平底燒瓶中，經(jīng)40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮近干，通氮?dú)獯蹈?，殘留物用二次水定容? mL，備用。

準(zhǔn)確稱取20 g蔬菜樣品，絞碎混勻，分別加入5 g NaCl，20 mL丙酮溶液，10 mL二氯甲烷，經(jīng)過(guò)高速勻漿后，濾液倒入分液漏斗中靜置分層，上清液轉(zhuǎn)移到燒杯中。于上清液加入5 g無(wú)水硫酸鈉，震蕩混勻后，靜置15 min。過(guò)濾，濾液于35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮近干。殘留物用二次水定容至1 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 伏草隆分子印跡膜的電聚合過(guò)程

鄰苯二胺與伏草隆可以通過(guò)借助弱氫鍵結(jié)合，其在金電極表面的電聚合過(guò)程是不可逆的，如圖2所示，鄰苯二胺在金電極表面于0.5 V附近有明顯的氧化峰而沒(méi)有還原峰。隨著聚合圈的增加，該氧化峰電流不斷減小，這是由于致密的非導(dǎo)電的鄰苯二胺和伏草隆不斷地聚合覆蓋在金電極表面，形成MIP，阻礙電子傳遞到電極表面。當(dāng)聚合圈數(shù)達(dá)到25圈時(shí)，電流變得很小，這說(shuō)明了MIP已經(jīng)成功在電極表面形成。

2.2 分子印跡膜的表征

由于伏草隆不是電活性物質(zhì)，在金電極上于-0.2 ～0.8 V范圍內(nèi)沒(méi)有氧化還原峰，因此選擇K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]作為探針，表征電極與底液之間的電流響應(yīng)。

MIP洗脫除去模板分子得到印跡孔穴可以作為電子傳遞的通道。這個(gè)通道的暢通和封堵會(huì)引起電極在K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]探針底液中的氧化還原峰電流的變化。如圖3所示，當(dāng)致密的非導(dǎo)電的MIP在金電極表面形成后，極大地阻礙了電子的傳遞，因此峰電流急劇變?。ㄇ€a到曲線b）。而洗脫模板分子后，由于出現(xiàn)印跡孔穴為電子的傳遞提供通道，探針在電極上的響應(yīng)電流重新變大（曲線c）。當(dāng)洗脫后的傳感器置于不同濃度的伏草隆中進(jìn)行重吸附后，印跡孔穴被伏草隆重新占據(jù)封堵，電流再次減小。由于伏草隆的濃度不同，被封堵的孔穴數(shù)量不同，因此電流減小的量也不同（曲線d和曲線e）。而對(duì)于非分子印跡膜來(lái)說(shuō)，由于沒(méi)有模板分子存在，因此洗脫后不會(huì)出現(xiàn)印跡孔穴作為電子傳遞的通道，因此洗脫前后電流幾乎不發(fā)生變化（曲線f到曲線g）。以上結(jié)果說(shuō)明了MIP已經(jīng)成功制備，并且可以對(duì)伏草隆產(chǎn)生響應(yīng)。

同樣采用AC對(duì)電極表面的阻抗變化進(jìn)行表征分析。如圖4所示，當(dāng)MIP在金電極表面形成后，由于MIP是致密和非導(dǎo)電的，因此電極表面的電阻極大的增加（曲線a到曲線b）；而洗脫除去模板分子后，出現(xiàn)印跡孔穴為電子傳遞提供通道，從而利于電子的傳遞，使得電極表面的電阻重新降低（曲線c）；當(dāng)重新吸附模板分子后，印跡孔穴再次被封堵，電極表面電阻又再次增大，并且隨著封堵的孔穴數(shù)量不同，電阻大小也不同（曲線d和曲線e）。以上結(jié)果同樣說(shuō)明MIP已經(jīng)在電極表面成功制備。

2.3 分子印跡膜聚合圈數(shù)的選擇

聚合圈數(shù)決定著MIP的厚度，從而影響傳感器的性能。如果聚合圈數(shù)較少，得到的印跡膜會(huì)很薄而且不穩(wěn)定；而如果聚合圈數(shù)較多，膜的就會(huì)較厚，印跡上去的模板分子容易被包埋，難以洗脫，同時(shí)也會(huì)影響傳感器的電流響應(yīng)信號(hào)。試驗(yàn)考察了不同圈數(shù)聚合MIP對(duì)傳感器性能的影響，結(jié)果表明聚合圈數(shù)為25圈時(shí)，效果最佳。因此，選擇25圈為電聚合MIP的圈數(shù)。

2.4 洗脫時(shí)間的優(yōu)化

將模板分子從MIP上洗脫除去，制備得到保留有特異性識(shí)別孔穴的MIP所需要的時(shí)間稱為洗脫時(shí)間。將聚合后的傳感器浸泡于50%的乙酸溶液中，在攪拌的情況下進(jìn)行洗脫。每隔2 min進(jìn)行1次DPV檢測(cè)，當(dāng)洗脫進(jìn)行6 min以后，電流響應(yīng)達(dá)到最大，之后穩(wěn)定不變。因此，選擇6 min為最優(yōu)洗脫時(shí)間。

2.5 重吸附時(shí)間的優(yōu)化

伏草隆分子到達(dá)MIP重新占據(jù)印跡孔穴的時(shí)間稱為重吸附時(shí)間。將洗脫模板分子后的傳感器置于伏草隆中進(jìn)行重吸附，每隔2 min進(jìn)行1次DPV檢測(cè)，隨著伏草隆不斷地被重吸附，越來(lái)越多的印跡孔穴被占據(jù)，電流響應(yīng)值不斷減小，直到6 min后達(dá)到最小，穩(wěn)定不再變化。因此，選擇6 min為最優(yōu)重吸附時(shí)間。

2.6 工作曲線

洗脫后的傳感器分別置于不同濃度的伏草隆溶液中進(jìn)行重吸附，然后在K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]溶液中進(jìn)行DPV檢測(cè)。如圖5所示，隨著伏草隆不斷地重新吸附到MIP上，越來(lái)越多的印跡孔穴被封堵，氧化電流不斷減小。電流的變化值△I與伏草隆溶液的濃度c在5×10-9～2×10-7 mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為△I=1.31 c（10-9 mol/L）+ 23.0，相關(guān)系數(shù)r=0.998 6，方法的檢出限為1.7×10-9 mol/L。

2.7 傳感器選擇性試驗(yàn)

選擇性是考察傳感器性能的重要指標(biāo)，為了考察傳感器的對(duì)伏草隆選擇性識(shí)別的能力，分析與伏草隆分子結(jié)構(gòu)相似的其他苯基脲類除草劑對(duì)傳感器選擇性的干擾。該試驗(yàn)是2×10-8 mol/L伏草隆分別與50倍濃度不同干擾物質(zhì)混合后，進(jìn)行重吸附試驗(yàn)檢測(cè)DPV響應(yīng)電流值。結(jié)果表明，50倍濃度的異丙隆、綠麥隆、異丙威、敵草隆對(duì)傳感器DPV信號(hào)基本沒(méi)有影響。這是由于MIP上的印跡孔穴具有特異識(shí)別伏草隆的結(jié)合位點(diǎn)，這些結(jié)合位點(diǎn)能夠與伏草隆發(fā)生特異性識(shí)別作用，而其他的除草劑盡管結(jié)構(gòu)上與伏草隆相似，但是并不能被結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別。此外，常見(jiàn)陰離子和部分的金屬離子對(duì)體系的DPV響應(yīng)信號(hào)的影響較小，幾乎可以忽略不計(jì)。說(shuō)明該傳感器對(duì)伏草隆具有良好的選擇性識(shí)別能力。

2.8 傳感器的穩(wěn)定性

傳感器在非實(shí)驗(yàn)時(shí)間保存于4 ℃冰箱中，不定期檢測(cè)DPV響應(yīng)信號(hào)表明，7 d后電流值基本無(wú)變化，15 d后電流值下降了約7.2%。表明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

2.9 樣品檢測(cè)

按照試驗(yàn)方法，對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。結(jié)果如表1所示，方法的回收率為93.0%～105.6%。

3 討論與結(jié)論

本研究制備了一個(gè)基于門(mén)控制效應(yīng)的分子印跡電流型傳感器用于伏草隆殘留的檢測(cè)。試驗(yàn)中利用模板分子離開(kāi)MIP時(shí)留下的孔穴，測(cè)量探針?lè)肿舆M(jìn)入孔穴進(jìn)行電極反應(yīng)產(chǎn)生的電流，從而達(dá)到間接檢測(cè)伏草隆的目的。在MIP的制備過(guò)程中采用循環(huán)伏安法聚合，該方法可以通過(guò)調(diào)控電荷量對(duì)膜的厚度進(jìn)行選擇。相對(duì)于其它制備MIP的方法，電化學(xué)法制備的聚合膜具有速度快、直接成膜等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)MIP具有較大的剛性，目標(biāo)分子的洗脫過(guò)程對(duì)印跡孔穴的構(gòu)型影響較小，膜的重復(fù)性好。常見(jiàn)的分子印跡電化學(xué)傳感器通常是直接檢測(cè)目標(biāo)分子的電流，往往由于物質(zhì)本身電活性的影響，電流強(qiáng)度較小，靈敏度不高。而本研究提出的傳感器由于K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]探針?lè)肿訚舛雀?、電活性?qiáng)，檢測(cè)電流強(qiáng)度較高，從而進(jìn)一步的提高方法的靈敏度。該方法應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)，方法的檢出限、回收率和精密度均優(yōu)于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2，5]。因此，基于門(mén)控制效應(yīng)的分子印跡傳感器分析速度快，無(wú)需大型儀器，選擇性好，響應(yīng)迅速，檢出限低，為農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染物的分析以及食品安全監(jiān)測(cè)提供新的參考。

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