曾慶才等

摘 要 以微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術帶來的新興農業(yè)副產物——微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料為主要培養(yǎng)基質，以產孢量為指標，通過單因素，響應面分析法優(yōu)化生防菌哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵的培養(yǎng)基。單因素結果表明：發(fā)酵培養(yǎng)基主成份微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料與麩皮的比例為9 ∶ 1；最適疏松值、無機碳源和無機氮源分別為麥粒40.00%、蔗糖3.00%和硫酸銨2.00%。響應面分析結果表明，麥粒、蔗糖、硫酸銨對哈茨木霉產孢量存在顯著相關性（p<0.05）。通過求解回歸方程可得：當微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料 ∶ 麩皮=9 ∶ 1、麥粒含量36.74%、蔗糖含量3.07%、硫酸銨含量1.75%時，孢子產量最高，可達2.98×109個/g，與實際值相近。

關鍵詞 哈茨木霉；固體發(fā)酵；培養(yǎng)基優(yōu)化

中圖分類號 S763.15 文獻標識碼 A

Optimization of Solid-state Fermentation Culture Medium Consisted

of the Microbial Fermentation Bed for the Biocontrol

Strain of Trichoderma harzianum FJAT-9040

by Response Surface Methodology

ZENG Qingcai1，2， XIAO Rongfeng2， LIU Bo2 *， HU Guiping2， CHEN Yanping2

1 College of Biological Science and Technology， Fuzhou University， Fuzhou， Fujian 350108， China

2 Agricultural Bioresource Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract The optimization of solid-state fermentation culture medium for a biocontrol strain Trichoderma harzianum FJAT-9040 was studied using single factor analysis and response surface methodology（RSM）. The medium mainly contained pig litter， which was produced from microbial fermentation bed for raising pigs， and the sporulation yield was used as the indicator in all tests. The results of single factor tests showed that the ratio of pig litter and wheat bran， the content of wheat grain， carbon and nitrogen were 9 ∶ 1， 40.00% of wheat grain， 3.00% of sucrose， and 2.00% of ammonium sulfate， respectively. The results showed that wheat grain， sucrose and ammonium sulfate were significant for the spore of T. harzianum based on the response surface methodology analysis（p<0.05）. The optimal medium constitutes were as followed： 9 ∶ 1 of pig litter and wheat bran， wheat grain 36.74%， sucrose 3.07%， ammonium sulfate 1.75%， and the average yield of spore reached to 2.98×109 cfu/g， which was close to the actual fermentation.

Key words Trichoderma harzianum； Solid-state fermentation； Medium optimization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.026

木霉菌（Trichoderm. spp），廣泛分布于土壤中，其生命力強，適應性廣，對許多植物病原真菌有拮抗作用[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計，已對18個屬29種植物病原真菌具有拮抗作用[2]。因此，木霉菌作為一類具有重要生防價值的生防菌而倍受關注[3]。目前已有大量這類木霉菌的報道，如哈茨木霉（T. harzianum）、綠色木霉（T. viride）、鉤狀木霉（T. hamatum）、康寧木霉（T. koninngii）等[4]。其中哈茨木霉的研究與應用報道居多，李良等[5]利用哈茨木霉進行茉莉白絹病的防治，防治效果顯著，可達90%以上。李瓊芳等[6]將哈茨木霉T23、T158的孢子菌劑用于麥冬等根腐病的防治，防治效果較好，且優(yōu)于化學農藥多菌靈粉。其它研究結果表明，其對黃瓜枯萎病[Erwinia amylovora var.tracheiphila（Smith）Dye]、小麥紋枯?。≧hizotonia cerealis van der Hoeven apud. Boerema & Verhoeven）、番茄灰霉病（Botrytis cinerea）等病原真菌也有抑制作用[7-9]；對黃瓜、花生和茄子等多種作物有促進生長作用[10-12]；可誘導水稻產生抗病性[13]等。目前已有商品化的生防菌劑，如美國的哈茨木霉T-22，Topshield和以色列的哈茨木霉T-39，Trichodex等[14]。

在防治和生產中，木霉菌防治效果與其發(fā)酵生產關系緊密。目前，木霉的防治多采用孢子菌劑，雖然不少學者對其代謝產物在生防作用上進行了研究[15-17]，但由于代謝產物的結構復雜，樣品處理難度大，生產成本高，最終限制其在工業(yè)上的應用。在生產實踐中通過發(fā)酵方式（液體發(fā)酵或固體發(fā)酵）可以提高孢子數(shù)量。但是液體發(fā)酵所需設備相對復雜，且存在發(fā)酵產物濃度不高，生產成本高等問題[18]，而固體發(fā)酵具有培養(yǎng)基來源豐富，價格低廉，操作簡單，孢子質量好等一系列優(yōu)勢，被公認為是獲得真菌孢子的最好方法之一[19]。固體發(fā)酵的培養(yǎng)基可以是稻草、麩皮、秸桿等農業(yè)副產物。近年來興起的微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬技術帶來了新的農業(yè)副產物——微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料，其含有豐富的養(yǎng)料，它是通過微生物將谷殼，鋸末等發(fā)酵床原料及豬糞、尿等混合物中的有機物質進行分解發(fā)酵而成[20]。若將其作為固體發(fā)酵的培養(yǎng)基，能為菌株提供豐富的營養(yǎng)物質，不但可以獲得大量的生防因子，還可以處理一些農業(yè)副產物，提高資源的利用價值，實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。微生物發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化方法很多，如單因素實驗法、正交設計試驗法、響應面優(yōu)化設計法等[21]，其中響應面優(yōu)化設計以試驗次數(shù)少，周期短等優(yōu)勢受到廣泛應用[22]。響應面分析法是通過合理的實驗設計，獲得一定數(shù)據(jù)來擬合一個響應面，從而摸擬出真實的極限條件下的曲面，并進行可靠性地分析[23]。響應面分析法可以對一次項、二次項及其交互項對響應值的影響進行分析，通過之間的關系在響應面上獲得最佳點，在試驗設計與試驗分析上具有更多優(yōu)勢[23]。本研究以微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料作為哈茨木霉FJAT-9040固體發(fā)酵的主要培養(yǎng)基原料，通過單因素實驗與響應面法優(yōu)化該菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方，篩選出最適產孢的培養(yǎng)基配方，旨在進一步提高產孢量和農業(yè)副產物的利用率，為哈茨木霉的生物菌肥和制劑的工業(yè)化生產提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 哈茨木霉FJAT-9040，福建省農業(yè)科學院農業(yè)生物資源所微生物菌種保存中心保存。在PD培養(yǎng)基中，28 ℃，170 r/min，培養(yǎng)4 d，無菌濾網過濾除去菌絲，制成孢子液，并稀釋至1.00×107個/mL，備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，瓊脂17～20 g，pH自然。PD為不加瓊脂液體培養(yǎng)基。馬鈴薯購于福建永輝超市；葡萄糖來源于國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂購于北京奧博星生物技術有限責任公司。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬副產物——發(fā)酵一年微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料（主要成分為谷殼，鋸末）、麩皮、麥粒、碳源、氮源、自來水等按適合比例混合。微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料來源于廈門某部隊后勤豬場；麩皮、麥粒來源于福州倉山；硝酸鈉來源于國藥集團化學試劑有限公司；蔗糖、乳糖、硫酸銨來源于天津市福晨化學試劑廠；硝酸銨來源于上海品杰化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單因素優(yōu)化設計 以產孢量為指標，采用單因子法篩選菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成份配比、麥粒、碳源和氮源，確定最適因子。

（1）固體發(fā)酵培養(yǎng)基主要成份微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料與麩皮配比的篩選。主要成份微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料與麩皮按體積比為10 ∶ 0，9 ∶ 1，8 ∶ 2，7 ∶ 3，

6 ∶ 4，5 ∶ 5，0 ∶ 10等配制7種培養(yǎng)基，每處理重復3次。每200.00 mL培養(yǎng)瓶中裝入50.00 mL培養(yǎng)基，初始含水量40.00%，滅菌后，接入哈茨木霉FJAT-9040孢子液，28 ℃恒溫發(fā)酵5 d。取5.00 g固體發(fā)酵物于45.00 mL無菌水中，攪拌均勻，稀釋至適當倍數(shù)，吸取100 μL，均勻涂布于含300 μg/mL鏈霉素的PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，記錄平板上萌發(fā)的孢子數(shù)。每克孢子數(shù)=同一稀釋度平均孢子數(shù)×10×稀釋倍數(shù)/5。篩選出最佳的主要成份配方比例。

（2）培養(yǎng)基中麥粒含量對哈茨木霉FJAT-9040產孢量的影響。往（1）中篩選出的培養(yǎng)基中添加浸泡過夜的麥粒，按體積比為10.00%、20.00%、30.00%、40.00%、50.00%進行添加，每處理重復3次。以下處理方法同（1）。篩選出最佳的疏松值（麥粒）含量。

（3）培養(yǎng)基中無機碳源對哈茨木霉FJAT-9040產孢量的影響。往（1）中篩選出的培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖、蔗糖、乳糖，每處理重復3次。以下處理方法同（1）。篩選出最佳的無機碳源及最適濃度。

（4）培養(yǎng)基中無機氮源對哈茨木霉FJAT-9040產孢量的影響。往（1）中篩選出的培養(yǎng)基中添加硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉，每處理重復3次。以下處理方法同（1）。篩選出最佳的無機氮源及最適濃度。

1.2.2 響應面優(yōu)化設計 在單因素篩選實驗的基礎上，根據(jù)Box-Benhnken設計原理，采用軟件Design-expert 8.0進行3因素3水平的響應面分析實驗，以孢子數(shù)為響應量，確定各因素對菌株產孢量影響的顯著性和各組分的最佳組合。以響應因子Y為產孢量，麥粒（x1）、蔗糖（x2）和硫酸銨（x3）為3因素，因素3水平分別為：-1、0和1。實驗設計具體見表1。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理及驗證實驗 數(shù)據(jù)分析通過EXCEL處理，統(tǒng)計學分析通過DPS軟件處理，響應面分析法利用Design-expert 8.0軟件采用Box-Benhnken設計方法，對培養(yǎng)基成分進行3因素3水平優(yōu)化。根據(jù)響應面預測的最佳培養(yǎng)基配方，按照1.2.1中（1）的方法操作，測定菌株的產孢量，以驗證響應面預測的準確性。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基的單因子優(yōu)化

2.1.1 固體發(fā)酵培養(yǎng)基主要成份微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料與麩皮配比的篩選 不同配比的微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料與麩皮對菌株產孢量的影響見圖1。圖1表明：菌株接種到不同比例的墊料與麩皮中，其產孢量差異很大，在全墊料培養(yǎng)基中的孢子數(shù)含量為1.80×106個/g；而在全麩皮培養(yǎng)基中的孢子含量僅為3.00×105個/g，數(shù)量最少。當墊料 ∶ 麩皮=9 ∶ 1時，產孢量最大，達到4.60×106個/g；當墊料 ∶ 麩皮=8 ∶ 2時，產孢量次之，達4.20×106個/g。當墊料 ∶ 麩皮=9 ∶ 1或8 ∶ 2時，發(fā)酵效果較好，且9 ∶ 1時產孢量最高。因此，選擇該比例為菌株固體發(fā)酵培養(yǎng)基主要成份的最佳配比。

2.1.2 培養(yǎng)基中麥粒含量對哈茨木霉FJAT-9040產孢量的影響 菌株在不同麥粒含量的培養(yǎng)基中產孢情況見圖2。從圖2可見，在一定體積范圍內，隨著麥粒含量的增加，哈茨木霉產孢量升高。當麥粒添加量在10.00%～30.00%時，菌株產孢量均在1.00×106個/g以上；當添加40.00%體積的麥粒時，產孢量最大，達到2.33×107個/g，遠高于對照組的產孢量，3.33×106個/g；當添加50.00%體積的麥粒時，產孢量有所減少，為1.13×107個/g。

2.1.3 培養(yǎng)基中無機碳源對哈茨木霉FJAT-9040產孢量的影響 菌株在不同碳源下的產孢情況見圖3。由圖3可知，不同種類的無機碳源對產孢量有一定的影響。當添加無機碳源為蔗糖時，產孢量最大，達到6.67×107個/g，其后依次為乳糖，葡萄糖。隨著蔗糖含量的增加，菌株的產孢量先增加后減少（圖4）。當添加濃度為3.00%時，產孢量最大，達到3.37×108個/g。

2.1.4 培養(yǎng)基中無機氮源對哈茨木霉FJAT-9040產孢量的影響 菌株在不同氮源下的產孢情況見圖5。當添加無機氮源為硫酸銨時，產孢能力最強，產孢量最大，達到1.47×109個/g。而硝酸銨和硝酸鈉對菌株的產孢并無明顯差異，其產孢量一致，均為1.00×109個/g。在添加硫酸銨范圍內，隨著添加量的增加，菌株產孢量先增加后下降（圖6）。當添加1.00%或2.00%時，發(fā)酵效果較好，且2.00%時，產孢量最高。

2.2 固體培養(yǎng)基重要營養(yǎng)成分含量響應面優(yōu)化

2.2.1 響應面法優(yōu)化實驗 根據(jù)單因素實驗結果，以微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料為基礎，麥粒含量為30.00%～50.00%（V/V），蔗糖濃度為2.00%～4.00%，硫酸銨濃度為1.00%～3.00%，進行響應面優(yōu)化實驗設計，結果見表2。

2.2.2 二次響應面回歸模型的建立及方差分析

經優(yōu)化后培養(yǎng)基組成為麥粒含量36.74%，蔗糖含量3.07%，硫酸銨含量1.75%，在發(fā)酵溫度28 ℃，接種量5%，含水量40%的條件下發(fā)酵5 d，孢子產量可達2.80×109個/g。陳欣等[33]通過中心組合實驗設計得到盾殼霉（Coniothyrium minitans）產孢的最優(yōu)培養(yǎng)基組合，且在此組合下每克麩皮產孢量可達1.04×1010個/g。本研究組合以微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料為主，為微生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料的運用提供了一條新出路，避免了隨意丟棄造成的環(huán)境污染及資源浪費，實現(xiàn)資源地循環(huán)利用，同時該組合實驗效果與孫斐[24]、劉時輪[27]、王永東[29]等人的研究結果相近，說明該組合可為含哈茨木霉的生物肥料和生物制劑生產提供理論指導。

參考文獻

[1] 張愛萍. 木霉生防作用研究進展[J]. 綠色植保， 2009（3）： 36.

[2] 陳 捷， 朱潔偉， 張 婷， 等. 木霉菌生物防治作用機理與應用研究進展[J]. 中國生物防治學報， 2011， 27（2）： 145-151.

[3] 莊敬華， 陳 捷， 楊長成， 等. 生防木霉菌生物安全性評價[J]. 中國農業(yè)科學， 2006， 39（4）： 715-720.

[4] 彭可為， 李 嬋. 木霉菌的生物防治研究進展[J]. 安徽農業(yè)科學， 2010， 38（2）： 780-782.

[5] 李 良， 申功進， 邵志和. 哈茨木霉對茉莉白絹病的生物防治的研究[J]. 浙江農業(yè)大學學報， 1983， 9（3）： 221-225.

[6] 李瓊芳， 曾華蘭， 葉鵬盛， 等. 哈茨木霉（Trichoderma harzianum）T23生防菌篩選及防治中藥材根腐病的研究[J]. 西南大學學報： 自然科學版， 2007， 29（11）： 119-122.

[7] Bhuyan S A. Antagonistic effective of Trichoderma viride， T. Harzianum and Asperigillus terreus on Rhizoctonia solani causing sheath blight of rice[J]. Journal of the Agricultural Science Society of North East India， 1994， 7（1）： 125-127.

[8] 劉愛榮， 陳雙臣， 陳 凱， 等. 哈茨木霉對黃瓜尖孢鐮刀菌的抑制作用和抗性相關基因表達[J]. 植物保護學報， 2010， 37（3）： 249-254.

[9] 管懷驥， 陳 莉. 哈茨木霉TH-1菌株對小麥紋枯病的控制效果研究[J]. 安徽農業(yè)科學， 2011， 39（16）： 9 664-9 665.

[10] 姚 彬， 王傲雪， 李景富. 哈茨木霉對4種番茄病原真菌抑制作用的研究[J]. 東北農業(yè)大學學報， 2009， 40（5）： 26-31.

[11] 楊春林， 席亞東， 劉波微， 等. 哈茨木霉T-h-30對幾種蔬菜的促生作用及病害防治初探[J]. 西南農業(yè)學報， 2008， 21（6）： 1 603-1 607.

[12] 王獻慧， 梁懷志， 魏 林. 哈茨木霉T2-16菌劑不同使用方法對花生防病促生長效果的研究[J]. 花生學報， 2012， 41（2）： 24-27.

[13] 胡 潔， 秦克偉， 蔡 楓， 等. 哈茨木霉SQR-T037對茄子幼苗促生效應的研究[J]. 安徽農業(yè)科學， 2012， 40（32）： 15 671-15 673， 15 694.

[14] 李 杰， 王景勝， 肖連冬， 等. 綠色木霉-M1固態(tài)發(fā)酵產纖維素酶條件研究[J]. 現(xiàn)代農業(yè)科技， 2011， 12： 49-51.

[15] 王紅梅， 蔣立科， 陶 芳， 等. 哈茨木霉高產幾丁質酶菌株的篩選及產酶條件研究[J]. 浙江大學學報（農業(yè)與生命科學版）， 2010， 36（2）： 146-152.

[16] 郭培磊， 劉 限， 高增貴， 等. 木霉菌胞外酶及對番茄灰霉病菌作用的研究[J]. 北方園藝， 2009（8）： 126-128.

[17] Nzojiyobiri jean Berchmans， 徐 同， 宋鳳鳴， 等. 哈茨木霉NF9菌株對水稻的誘導抗病性[J]. 中國生物防治， 2003， 19（3）： 111-114.

[18] 葛 龍， 趙 艷， 章亭洲. 固態(tài)發(fā)酵技術的特點與應用[J]. 飼料與畜牧， 2010（8）： 54-56.

[19] 敖新宇， 程立君， 陳玉惠. 生防木霉SS003菌株（Trichoderma atroviride）的固體發(fā)酵工藝研究[J]. 江西農業(yè)大學學報， 2012， 34（6）： 1256-1261.

[20] 藍江林， 劉 波， 陳 崢， 等. 微生物發(fā)酵床豬舍環(huán)境氣味電子鼻判別模型的研究[J]. 福建農業(yè)學報， 2012， 27（1）： 77-86.

[21] 肖懷秋， 李玉珍. 微生物培養(yǎng)基優(yōu)化方法研究進展[J]. 釀酒科技， 2010（1）： 90-94.

[22] 郝學財， 余曉斌， 劉志鈺， 等. 響應面方法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應用[J]. 食品研究與開發(fā)， 2006， 127（1）： 38-40.

[23] 張秀霞， 吳佳東， 滕 芝， 等. 響應面法優(yōu)化固定化微生物降解石油污染物[J]. 石油學報， 2012， 28（5）： 877-882.

[24] 孫 斐， 陳靠山， 張鵬英， 等. 固態(tài)發(fā)酵麩皮和玉米芯生產擬康氏木霉孢子的研究[J]. 中國農學通報， 2010， 26（6）： 236-239.

[25] 夏斯琴， 王 偉. 綠色木霉T4的固體發(fā)酵工藝及其制劑穩(wěn)定性的研究[J]. 化學與生物工程， 2008， 25（12）： 52-56.

[26] 劉時輪， 李 勇， 傅俊范， 等. 綠色木霉菌株Tv04-2固體發(fā)酵條件研究[J]. 華北農學報， 2008， 23： 244-247.

[27] 趙永強. 木霉菌對大豆根腐病菌的生防機制及其制劑的初步研究[D]. 大慶： 黑龍江八一農墾大學， 2010.

[28] 茹水江. 木霉顆粒劑ST-6的研制及其應用研究[D]. 杭州： 浙江大學， 2010.

[29] 王永東， 蔣立科， 岳永德， 等. 生防菌株哈茨木霉H-13固體發(fā)酵條件的研究[J]. 浙江大學學報（農業(yè)與生命科學版）， 2006， 32（6）： 645- 650.

[30] Ambat P， Ayyanna C. Optimizing medium constituents and fermentation conditions for citric acid production from palmyra jaggery using response surface methods[J]. Journal of Microbiology & Biotechnology， 2001， 17： 331-335.

[31] Ratnam B V V， Naras imha Rao M， Dmodar Rao M， et al. Optimization of fermentation conditions for the production of ethanol from sago starch using response surface methodology[J]. Journal of Microbiology & Biotechnology， 2003， 19： 523-526.

[32] Trupkin S， Levin S， Forchiassin F， et al. Optimization of a culture medium for ligninolytic enzyme production and synthetic dye decolorization using response surface methodology[J]. Journal of Industrial Microbiology Biotechnology， 2003， 30： 682-690.

[33] 陳 欣， 李 寅， 堵國成， 等. 應用響應面方法優(yōu)化Coniothyrium minitans固態(tài)發(fā)酵生產生物農藥[J]. 工業(yè)微生物， 2004， 34（1）： 26-29.