孫亞米 劉勇軍 趙健 葉宇飛 呂燕 吳銀良

摘 要：建立了采用多壁碳納米管為吸附劑的分散固相萃取凈化、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定雞肉中金剛烷胺殘留量的方法。雞肉樣品經(jīng)乙酸乙腈提取后，調(diào)節(jié)pH值至11，加入75 mg 多壁碳納米管進(jìn)行分散固相萃取，被吸附的藥物經(jīng)5.0%甲酸溶液：甲醇（5：5，v/v）洗脫，洗脫液過濾膜后直接進(jìn)樣分析。采用Acquity UPLC BEH C18色譜柱分離，以0.1%甲酸水溶液和甲醇作為流動相作梯度洗脫，電噴霧正電子（ESI+）模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，內(nèi)標(biāo)法校準(zhǔn)進(jìn)行定量。金剛烷胺在0.05～5.0 μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，雞肉樣品中最低定量限為0.50 μg/kg。雞肉樣品中添加0.5～1.0 μg/kg金剛烷胺的回收率在97.8 %～103.6 %之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10 %。

關(guān)鍵詞：金剛烷胺；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；多壁碳納米管；分散固相萃取

Determination of Amantadine in Chicken Muscle by Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry Coupled with Dispersive Solid Phase Extraction Using Multiwalled Carbon Nanotubes as Adsorbent

SUN Ya-mi1，Liu Yong-jun 2， ZHAO Jian1，YE Yu-fei1，LV Yan1，WU Yin-liang1，*

（1. The Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， China；

2. The Center for Animal Disease Control and Prevention， P.R. China， Beijing 100125， China）

Abstract：A simple， sensitive and reliable analytical method was developed for amantadine in chicken muscle by ultra high performance liquid chromatography-positive electrospray ionisation tandem mass spectrometry （UHPLC-ESI-MS/MS） using dispersive solid phase extraction （dSPE） with multi-walled carbon nanotubes （MWCNTs）. Chicken muscle was extracted using 1.0% acetic acid in acetonitrile. After adjusting pH value to 11， 75 mg of MWCNTs were added to absorpt amantadine and 5.0 % formic acid solution：methanol （5：5 v/v） was used to elute the compound from the MWCNTs. The eluate was directly analyzed by LC-MS/MS on an Acquity UPLC BEH C18 column with a mixture of methanol and 0.1% formic acid solution as the mobile phase. The samples were quantified with the internal standard calibration curve method. Good linearities were obtained for amantadine at the concentration of 0.05-5.0 μg/L with the linear relative coefficient more than 0.999. The recoveries for amantadine in chicken muscle were 97.8 %-103.6 % at the fortified levels of 0.5-1.0 μg/kg with the limit of quantitation of 0.5 μg/kg. The relative standard deviations were less than 10.0%.

Key words： amantadine； LC-MS-MS； MWCNTs； dispersive solid phase extraction

中圖分類號：TS251.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

金剛烷胺（amantadine）最早用于抑制人類流感病毒的抗病毒藥，同時也是帕金森綜合癥的治療藥物。但金剛烷胺對食用者可能產(chǎn)生嗜睡、失眠、眩暈、抑郁、惡心、食欲減退等多種不良反應(yīng)，具有一定的毒副作用。在畜牧養(yǎng)殖上，金剛烷胺主要用于雞禽流感的預(yù)防和早期治療，以及豬傳染性胃腸炎的防治，但長期使用金剛烷胺會使病毒產(chǎn)生耐藥性，因此美國食品與藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Adminitration，F(xiàn)DA）已明確禁止在畜禽養(yǎng)殖中使用此類藥物[1]。我國農(nóng)業(yè)部也于2005年發(fā)布了《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，明令禁止金剛烷胺類抗病毒藥物用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)[2]。然而目前我國畜禽飼養(yǎng)中濫用金剛烷胺現(xiàn)象依然存在，為保障公眾身體健康，急需建立動物性食品中快速、靈敏和準(zhǔn)確的金剛烷胺殘留量分析方法。

對于金剛烷胺類藥物殘留量的分析，在該類藥物禁止在動物生產(chǎn)中使用前樣品主要是生物體液，如血漿和尿液等。分析手段主要有氣相色譜（gas chromatography，GC）法[3]、液相色譜（liquid chromatography，LC）法[4-7]、毛細(xì)管電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）法[8]、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS-MS）法[9-12]等。近年來，對于動物性食品中金剛烷胺殘留量的分析已有一些報道[13-20]，但這些方法的前處理方法通常仍采用傳統(tǒng)的固相萃取手段，前處理相對較復(fù)雜。近年來碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）材料作為固相萃取填料在農(nóng)獸藥殘留分析中有一定的應(yīng)用，但作為分散固相萃?。╠ispersive solid phase extraction，dSPE）材料在農(nóng)獸藥殘留分析，特別是獸藥殘留分析中應(yīng)用非常少，至今尚未有關(guān)CNTs在金剛烷胺類藥物分析中的應(yīng)用。因此本研究就多壁碳米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）作為dSPE材料對雞肉中金剛烷胺的凈化方法進(jìn)行了研究，在優(yōu)化凈化前提取液pH值、MWCNTs種類和用量以及吸附時間的基礎(chǔ)上建立了操作簡便、靈敏度和重復(fù)性均較好的LC-MS-MS分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肉樣品 市購。

鹽酸金剛烷胺 美國Sigma-Aldrich公司；鹽酸金剛烷胺-D15標(biāo)準(zhǔn)品 加拿大Toronto Research Chemicals公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純） 美國默克公司；其他試劑均為分析純試劑。MWCNT01（外徑<8 nm，長度10～30 μm），MWCNT02（外徑10～20 nm，長度10～30 μm），MWCNT03（外徑20～30 nm，長度10～20 μm），MWCNT04（外徑30～50 nm，長度10～30 μm）和MWCNT05（外徑>50 nm，長度10～20 μm） 南京先鋒納米材料科技有限公司。MWCNT01-05的比表面積依次為500，200，110，60 m2/g和40 m2/g。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC XevoTM TQ MS超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Waters公司；SIGMA3K15離心機(jī) 北京博勵行有限公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液

稱取金剛烷胺和金剛烷胺-D15標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，分別用乙腈定容至刻度，即成質(zhì)量濃度100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，―18 ℃條件下保存，保質(zhì)期6個月。

1.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液

用0.1%甲酸水/甲醇（7：3，v/v）稀釋金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制質(zhì)量濃度分別為0.05、0.20、0.50、1.0、2.0 μg/L和5.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，各標(biāo)準(zhǔn)工作液中加1.0 μg/L金剛烷胺-D15，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

稱取雞肉樣品2.0 g，加入50 μL質(zhì)量濃度400 μg/L的內(nèi)標(biāo)工作液，混勻后加入10mL體積分?jǐn)?shù)為1.0 %乙酸乙腈溶液，以10000 r/min速度勻質(zhì)1 min，再以9500 r/min離心3 min，收集上清液。取2 mL上清液轉(zhuǎn)入50 mL塑料離心管中，加超純水18 mL進(jìn)行稀釋后調(diào)節(jié)pH至11.0，加入75 mg MWCNTs，渦旋5 min，9500 r/min離心3 min，棄去上清液，最后加入4 mL 體積分?jǐn)?shù)為5.0 %甲酸溶液：甲醇（5：5，v/v），渦旋1 min后以9500 r/min離心2 min，吸取上清液過0.22 ?m濾膜后供LC-MS-MS分析。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-甲醇（B）（梯度洗脫）；梯度洗脫程序：0～1.0 min，30%甲醇；1.0～3.0 min，30%～70%甲醇，保持0.5 min；3.5～3.6 min，70%～30%甲醇；再保持1.4min。流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件優(yōu)化時采用1000 μg/L的金剛烷胺和金剛烷胺-D15標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，利用IntelliStart軟件進(jìn)行優(yōu)化。

電離模式：ESI源正離子模式；多級反應(yīng)檢測（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細(xì)管電壓1.0 KV；萃取錐孔電壓30 V；RF透鏡電壓0.5 V；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣溫度500 ℃；錐孔氣流速50 L/h；脫溶劑氣流速1000 L/h；倍增器電壓650 V；二級碰撞氣：氬氣；各物質(zhì)的定性定量離子對等參數(shù)詳見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的選擇

目前發(fā)表的有關(guān)金剛烷胺類藥物的LC-MS/MS方法均采用電噴霧正離子（ESI+）模式監(jiān)測。本研究利用IntelliStart軟件在蠕動泵以20 L/min流速下對金剛烷胺和金剛烷胺-D15的質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，所有選擇的離子對（表1）在實際樣品分析時均不存在干擾。

在用LC-MS/MS分析時，流動相的組成和配比不但會影響目標(biāo)化合物的色譜行為，還會影響到目標(biāo)化合物的離子化效率，從而影響靈敏度。實驗選擇Acquity UPLC BEH C18柱為分離柱，發(fā)現(xiàn)在正離子模式和同樣的梯度條件下，采用0.1%甲酸溶液/甲醇作為流動相，金剛烷胺和金剛烷胺-D15的響應(yīng)明顯較0.1%甲酸溶液/乙腈作為流動相時高，因此本實驗中選擇0.1%甲酸溶液/甲醇作為流動相。經(jīng)上述儀器條件得到的標(biāo)準(zhǔn)工作液圖譜，詳見圖1，圖中可見金剛烷胺峰形良好。

縱坐標(biāo)為相對豐度（%）

圖中a1-a3為金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為0.10 ?g/L； b1-b3為雞肉空白樣品，c1-c3為添加樣品，添加濃度為1.0 ?g/kg

圖1 金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液、雞肉空白樣品和添加樣品MRM色譜圖

Fig.1 The MRM chromatograms of a working standard solution， blank chicken muscle sample and a fortified blank chicken muscle sample.

2.2 提取溶劑的選擇

甲醇和1.0%乙酸乙腈曾被用來提取雞組織中的金剛烷胺，為簡化提取步驟，實驗對2 g雞肉用10 mL甲醇或10 mL體積分?jǐn)?shù)為1.0%乙酸乙腈分別提取1次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對甲醇對金剛烷胺的提取回收率只有62.1%；而1.0%乙酸乙腈的提取回收率則達(dá)到了85.3%，因此本實驗選擇1.0%乙酸乙腈作為提取劑。

2.3 dSPE條件優(yōu)化

2.3.1 MWCNT種類選擇

實驗利用同樣質(zhì)量（100 mg）的5種MWCNT對經(jīng)超純水稀釋后的提取液進(jìn)行金剛烷胺吸附回收率實驗。如圖2所示，同一條件下比表面積較高的MWCNT回收率對金剛烷胺的吸附回收率較高；同時隨著溶液中水相比例的增高，5種MWCNT對金剛烷胺的吸附回收率明顯增高，因此實驗選擇比表面積最大（MWCNT01）和超純水：提取液比例為1：9進(jìn)行實驗。

圖2 不同比表面積MWCNT對提取液經(jīng)不同比例超純水稀釋后溶液中金剛烷胺的吸附影響

Fig. 2 The effects of different types of MWCNTs on the adsorption rates of amantadine in chicken muscle extract and different ratios of diluted chicken muscle extract with water.

2.3.2 MWCNT用量選擇和稀釋液pH值優(yōu)化

如圖3所示，隨著溶液pH值從4變化到11，吸附回收率緩慢上升，但當(dāng)溶液pH值超過11后，吸附回收率急劇下降。同時經(jīng)實驗表明MWCNT用量對吸附回收率實驗表明，隨著MWCNT用量從25 mg增加到75 mg，MWCNT對金剛烷胺吸附回收率明顯增加，MWCNT用量超過75 mg后，MWCNT對金剛烷胺的吸附回收率沒有明顯增加，因此實驗選擇調(diào)節(jié)稀釋液pH值至11和75 mg MWCNT對金剛烷胺進(jìn)行MWCNT吸附實驗。

圖3 不同pH條件下對金剛烷胺吸附回收率的影響

Fig. 3 The effects of different types of MWCNTs on the adsorption rates of amantadine in chicken muscle extract and different ratios of diluted chicken muscle extract with water.

2.3.3 洗脫液的選擇和優(yōu)化

如圖4可知，當(dāng)洗脫液中甲酸溶液和甲醇比例為5：5時，金剛烷胺在各甲酸濃度點(diǎn)的回收率均高于相應(yīng)甲酸溶液和甲醇比例為時的7：3回收率；同時當(dāng)甲酸溶液中甲酸濃度在5.0%以上并且甲酸溶液和甲醇比例為5：5時，金剛烷胺的回收率隨甲酸濃度的增加沒有較明顯的增加，因此本實驗最終選擇洗脫液中甲酸溶液和甲醇的比例為5：5，甲酸濃度為5.0%。

圖4 洗脫液中甲酸濃度對金剛烷胺洗脫回收率的影響

Fig. 4 The effects of different solvents as eluents at different formic acid concentrations on the recoveries of amantadine.

2.3 方法參數(shù)

2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

對金剛烷胺按照1.3.1節(jié)的步驟制備質(zhì)量濃度在0.05～5.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行LC-MS-MS分析后以定量離子對和內(nèi)標(biāo)離子對峰面積的比值對濃度作圖，所得曲線方程為y=0.4649x+0.0422，相關(guān)系數(shù)r=0.9995，說明本方法適用于雞肉中金剛烷胺的定量分析。

2.3.2靈敏度

根據(jù)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的結(jié)果，配制相近濃度的陽性添加樣品，測定其實際信噪比。以RSN=3為檢測限，以RSN=10為定量限。結(jié)果表明，雞肉樣品中金剛烷胺的檢出限為0.15 μg/kg，定量限為0.50 μg/kg。

2.3.3 準(zhǔn)確度和精密度

取空白雞肉樣品，加入標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制成0.50、0.75、1.0 μg/kg的加標(biāo)樣品，按照1.3.2節(jié)進(jìn)行操作，每個添加超純水平重復(fù)3次，每次每個濃度3個加標(biāo)樣品進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均小于10%，回收率均在97.8%～103.6%之間（表2），空白樣品和添加圖譜詳見圖1。

2.4 方法應(yīng)用

利用該方法在2013年底對寧波市江區(qū)大型超市所售24個雞肉樣品進(jìn)行了金剛烷胺殘留量測定，所有樣品均未檢出金剛烷胺。

3 結(jié) 論

建立了雞肉中金剛烷胺的快速測定LC-MS-MS方法。雞肉樣品經(jīng)酸化乙腈提取后，提取液經(jīng)稀釋后直接進(jìn)行以MWCNT為吸附材料的分散固相萃取凈化，洗脫液無需進(jìn)行其它操作可直接進(jìn)行LC-MS-MS法測定。該方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可適用于我國對金剛烷胺在動物生產(chǎn)中非法使用的監(jiān)控要求。

參考文獻(xiàn)：

[1] U.S. FDA. FDA prohibits use of antiviral drugs in poultry to help keep drugs effective for humans [EB/OL]. [2014-03-15]. http：//www.fda.gov/News Events/Newsroom/Press Announcements/2006/ucm108620. html.

[2] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部560號公告 獸藥地方標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄[EB/OL]. [2014-03-15]. http：//www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/gg/200511/t20051117_496523.html.

[3] 韓加怡， 傅紅云. 毛細(xì)管氣相色譜法測定復(fù)方鹽酸金剛乙胺膠囊中的鹽酸金剛乙胺[J]. 色譜， 2005， 23（6）： 683

[4] 修虹， 黃榕珍， 付梅春. HPLC-ELSD法測定復(fù)方氨酚烷胺膠囊中鹽酸金剛烷胺及對乙酰氨基酚的含量[J]. 中國藥品標(biāo)準(zhǔn)， 2006， 7（1）： 23-25.

[5] HIGASHI Y， UEMORI I， FUJII Y. Simultaneous determination of amantadine and rimantadine by HPLC in rat plasma with pre-column derivatization and fluorescence detection for pharmacokinetic studies[J]. Biomedical Chromatography， 2005， 19（9）655-662.

[6] HIGASHI Y， FUJII Y. Simultaneous determination of the binding of amantadine and its analogues to synethetic melanine by liquid chromatography after precolumn derivatization with dansylchloride[J]. Journal of Chromatography Science， 2005， 43（4）： 213-217.

[7] CUI SJ， FENG F， LIU H， et al. New method for high-performance liquid chromatographic determination of amantadine and its analogues in rat plasma[J]. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis， 2007， 44（5）： 1100-1105.

[8] REVILLA AL， HAMACEK J， LUBAL P. Determination of rimantadine in pharmaceutical preparations by capillary zone electrophoresis with indirect detection or after derivatization [J]. Chromatographia， 1998， 47（7/8）： 433-439

[9] ARNDT T， GUESSREGEN B， HOHL A， et al. Determination of serum amantadine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Clinica Chimica Acta， 2005， 359（1/2）： 125-131.

[10] WANG P， LIANG YZ， CHEN BM， et al. Quantitative determination of amantadine in human plasma by liquid chromatography-mass spectrometry and the application in a bioequivalence study [J]. Journal of pharmaceutical and biomedical analysis， 2007， 43（4）： 1519-1525.

[11] CHAN D， TARBIN J， SHAMAN M， et al. Screening method for the analysis of antiviral drugs in poultry tissues using zwitterionic hydrophilic interaction liquid chromatography/tandem mass spectrometry [J]. Analytica Chimica Acta， 2011， 700（1/2）： 194-200.

[12] 云環(huán)， 張朝暉， 羅生亮， 等. 固相萃取/LC-MS/MS法檢測動物源性食品中的金剛烷胺[J]. 現(xiàn)代儀器， 2009， 15（6）： 42-45.

[13] 陳慧華， 韋敏玨， 周煒， 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物組織中金剛烷胺和金剛乙胺的殘留量[J]. 質(zhì)譜學(xué)報， 2013， 34（4）： 226-232.

[14] 艾連峰， 馬育松， 陳瑞春， 等. 在線凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源食品中金剛烷胺的殘留[J]. 分析化學(xué)， 2013， 41（4）： 1194-1198.

[15] 劉正才， 楊方， 余孔捷， 等. 液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測雞組織中5種抗病毒類藥物的殘留量[J]. 色譜， 2012， 30（12）： 1253-1259.

[16] 邵琳智， 姚仰勛， 謝敏玲， 等. 親水相互作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物組織中金剛烷胺與利巴韋林[J]. 分析測試學(xué)報， 2013， 32（12）： 1448-1452.

[17] 魏秀麗， 高迎春， 陳玲， 等. 超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉組織中金剛烷胺殘留[J]. 中國獸藥雜志， 2013， 47（6）： 53-55.

[18] BERENDSEN B J A， WEGH R S， ESSERS M L， et al. Quantitative trace analysis of a broad range of antiviral drugs in poultry muscle using column-switch liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry [J]. Analytica and Bioanalytical Chemistry， 2012， 402： 1611-1623.

[19] YAN H， LIU X， CUI F， et al. Determination of amantadine and rimantadine in chicken muscle by QuEChERS pretreatment method and UHPLC coupled with LTQ Orbitrap mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B， 2013， 938： 8-13.

[20] 曲斌， 朱志謙， 陸桂萍， 等. UPLC-MS/MS快速測定雞肉中金剛烷胺和氟喹諾酮類藥物殘留[J]. 中國獸藥雜志， 2013， 47（7）： 50-54.