周 劍， 王 敏*， 楊夢瑞， 張立華

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與食物安全重點開放實驗室，北京 100081)

金剛烷胺是一種人用抗病毒藥物[1,2]，農(nóng)業(yè)部早在2005年就已公告明令禁止其在動物產(chǎn)品生產(chǎn)中使用[3]。因此，建立高準(zhǔn)確度動物產(chǎn)品中金剛烷胺檢測方法，能有效支撐對動物養(yǎng)殖過程中該藥物違規(guī)使用行為的監(jiān)管。目前已有多種高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)檢測動物源性食品中金剛烷胺[4 - 8]，然而這些方法都沒有對可能產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行研究。在樣品前處理和儀器分析過程中，流動相組分、樣品中與目標(biāo)分析物共提取的其他物質(zhì)也會同時進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)，這些物質(zhì)將會影響目標(biāo)分析物在質(zhì)譜中的離子化過程，使得目標(biāo)分析物的質(zhì)譜信號增強或者減弱，產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)[9]。2001年，美國食品藥品管理局在《生物分析方法驗證準(zhǔn)則》中明確要求：在HPLC-MS/MS分析方法開發(fā)和驗證過程中需要對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價[10]。

優(yōu)化改進(jìn)樣本尤其是生物樣本的前處理方法，并且采用待測物的同位素標(biāo)記物為內(nèi)標(biāo)是消除基質(zhì)效應(yīng)較有效的方法。為此，本文以同位素稀釋質(zhì)譜法為基礎(chǔ)，從絕對基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和方法過程效率等方面，系統(tǒng)考察了QuEChERS法和固相萃取(SPE)法兩種前處理方法對LC-MS/MS分析雞肉中抗病毒藥物金剛烷胺的基質(zhì)效應(yīng)的影響，從而選定合適的前處理方法，為動物源性產(chǎn)品中抗病毒藥物金剛烷胺監(jiān)測，以及雞肉粉中金剛烷胺分析基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制提供方法支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1200液相色譜儀(美國，Agilent公司)；API2000質(zhì)譜儀(美國，AB Sciex公司)；色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱(150×2.1 mm i.d.,3.5 μm)；VORTEX-5渦旋混合器(美國，Scientific industries公司)；EYELA旋蒸儀(日本，東京理化公司)；TTL-DCII氮吹儀(北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)；XS105DU電子天平(瑞士，梅特勒公司)；Oasis MCX固相萃取小柱(150 mg，6 mL)(美國，Waters公司)。移液器：1 000 μL，200 μL，20 μL(德國，Eppendorf 公司)。

金剛烷胺選用實驗室自行研制的國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(編號GBW(E)090594)；D15-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司；乙腈、甲醇、正己烷、甲酸(色譜純，德國Merck公司)；乙酸銨、無水硫酸鈉、乙酸、氨水(分析純，中國國藥試劑有限公司)；PSA：40～60 μm。實驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

金剛烷胺儲備液：直接選用GBW(E)090594，濃度1 001 μg/mL，不確定度10%；D15-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取10 mg D15-金剛烷胺于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋，配制濃度1 000 μg/mL；金剛烷胺和D15-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液均在-20 ℃保存。氨化甲醇溶液：準(zhǔn)確吸取2.5 mL氨水和2.5 mL乙酸銨溶液于100 mL容量瓶，用甲醇定容，混勻備用。

1.3 樣品的前處理方法

1.3.1QuEChERS法提?。悍Q取試樣2.0 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入D15-金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后加入乙腈(含1%乙酸)10 mL，漩渦2 min，3 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入另一50 mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，待凈化。凈化：備用液中加入無水Na2SO43 g，正己烷10 mL，渦旋1 min，3 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，剩余溶液轉(zhuǎn)至100 mL雞心瓶中，40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸干，用1 mL甲醇溶解殘渣。然后加入PSA 50 mg，渦旋30 s，取上清液過濾膜供LC-MS/MS測定。

1.3.2SPE法提?。悍Q取試樣2.0 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加入D15-金剛烷胺標(biāo)液，加入4 mL 20 g/L三氯乙酸溶液和1 mL乙腈，漩渦2 min，3 500 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入另一50 mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液備用。凈化：依次用3 mL甲醇、3 mL水活化Oasis MCX萃取小柱，移取10 mL備用液上樣(控制流速≤1 mL/min)；依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗Oasis MCX柱；然后真空抽干5 min，用3.5 mL氨化甲醇洗脫至5 mL玻璃管中，溫度 45 ℃下氮氣吹干。用1 mL乙腈-甲醇-水(體積比為90∶5∶5)溶液溶解殘渣，過0.22 μm濾膜，取上清液供LC-MS/MS測定。

1.4 儀器條件

1.4.1液相色譜條件分析柱采用Zorbax Eclipse Plus C18柱(150×2.1 mm,3.5 μm)；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫條件：0～4 min,95%B；4～5 min，95%～40%B；5～8 min，40%B；8～8.1 min，40%～95%B；8.1～10 min，95%B；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧正離子(ESI+)監(jiān)測模式，多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描模式；離子源噴射電壓4.5 kV；溫度：550 ℃；駐留時間：200 ms；霧化氣壓力(GS1)：50 psi；輔助氣壓力(GS2)：50 psi；氣簾氣壓力(CUR)：35 psi。金剛烷胺(準(zhǔn)分子離子峰m/z152、定量離子m/z135)、D15-金剛烷胺(準(zhǔn)分子離子峰m/z167.3、定量離子m/z150.3)。

2 結(jié)果與討論

2.1 QuEChERS法前處理條件的選擇

2.1.1提取劑的選擇根據(jù)金剛烷胺溶于2.5倍水、5倍的乙醇、18倍的氯仿，不溶于苯和乙醚的特點及相似相溶原理，實驗以旋蒸后離心管的狀態(tài)和提取效率為指標(biāo)，比較優(yōu)化了甲醇、乙腈以及分別加入三氯乙酸、1%乙酸和1%氨水條件下，不同提取劑的提取效果。提取效率采用SAS軟件進(jìn)行顯著性比較，結(jié)果表明選用乙腈/1%乙酸作為提取劑時，提取效率較好且實驗過程中樣品旋蒸后比較干凈，可知蛋白和脂肪去除效果較優(yōu)于其他提取劑，更便于下一步目標(biāo)物的凈化。

2.1.2凈化劑的選擇本文選取C18、PSA、硅藻土、弗羅里硅土四種凈化劑，以凈化后待上機液的顏色及譜圖雜質(zhì)峰多少為指標(biāo)，通過實驗對比可知，PSA和弗羅里硅土的凈化效果明顯優(yōu)于其他兩種，檢測中發(fā)現(xiàn)弗羅里硅土對金剛烷胺藥物的吸附作用比較大，最終選用PSA吸附劑進(jìn)行提取液的處理。

2.2 固相萃取前處理條件的選擇

2.2.1提取劑的選擇在分散固相萃取優(yōu)化中，最佳的提取溶劑是含有1%乙酸的乙腈，但固相萃取方法中，提取溶劑的性質(zhì)影響過SPE柱時待分析物的保留能力，所以應(yīng)重新優(yōu)化。實驗比較了2.1.1節(jié)中各種提取劑的提取效率，結(jié)果用回收率和SAS軟件比較，多次測量的統(tǒng)計結(jié)果顯示，含三氯乙酸的乙腈具有更高的提取效率，進(jìn)一步優(yōu)化比較含5、10、20、30 g/L三氯乙酸的乙腈的提取效率，綜合比較回收率和峰形等因素，選擇含20 g/L的三氯乙酸的乙腈為最佳提取劑。

2.2.2凈化條件的選擇由于在酸性提取條件下，金剛烷胺主要以離子形式存在，實驗比較了強陽離子交換柱SCX和混合陽離子交換柱MCX，結(jié)果顯示在常規(guī)的淋洗洗脫條件下，MCX柱就能取得相對較好的凈化效果，考慮金剛烷胺的pKa值大于9，采用堿化的甲醇更能提高淋洗效率，實驗比較了不同比例的氨化甲醇，最后確定5%氨化甲醇為最佳淋洗溶液。

2.3 色譜條件的選擇

基質(zhì)效應(yīng)主要出現(xiàn)在出峰較早的時間段，所以可使分析物的峰有一定的色譜保留，以降低基質(zhì)效應(yīng)。通過比較不同品牌的色譜柱，本實驗采用Zorbax Eclipse Plus C18柱(150×2.1 mm i.d.,3.5 μm)，將出峰時間調(diào)節(jié)至4.5 min以后進(jìn)行測定。因金剛烷胺易溶于水和乙醇，且其分子中含有氨基呈堿性，在酸性條件下易離子化提高質(zhì)譜的信號響應(yīng)；同時由于雞肉組織含大量蛋白質(zhì)和脂肪，故本方法采用有機相和酸性水溶液混合體系對金剛烷胺進(jìn)行提取。而當(dāng)流動相中加入甲酸時，可改善金剛烷胺的色譜峰形。由于甲酸的加入對結(jié)果影響不大，綜合考慮色譜柱壓力、儀器耐受、色譜峰形等多種因素，本方法采用乙腈和水(含0.1%甲酸)作為流動相。

2.4 質(zhì)譜條件的選擇

全掃描模式下，在正離子和負(fù)離子模式下分別進(jìn)行掃描，以確定分子離子峰和合適的電離方式。實驗結(jié)果表明，正離子模式下有更好的離子響應(yīng)，金剛烷胺類藥物均含有氨基，容易得到H+而形成較為穩(wěn)定的[M+H]+準(zhǔn)分子離子，所以選擇正離子模式。全掃描下確定的金剛烷胺和D15-金剛烷胺的母離子分別是m/z152.2和m/z167.3，在確定分子離子峰的情況下，采用LC-MS/MS的多重反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，主要優(yōu)化去簇電壓(Declustering Potential,DP)和碰撞能(Collision Energe，CE)，在碰撞誘導(dǎo)解離中，本實驗以氮氣作為碰撞氣體，得到金剛烷胺和D15-金剛烷胺的子離子分別是m/z分別是m/z135.2和150.3，在確定了母離子和子離子的條件下，對DP和CE分別進(jìn)行優(yōu)化，以保證得到的子離子有最大的離子響應(yīng)。實驗所得金剛烷胺和D15-金剛烷胺的離子質(zhì)譜條件見表1，樣品中金剛烷胺和D15-金剛烷胺提取離子色譜圖如圖1所示，MRM模式下子離子質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

表1 金剛烷胺和D15-金剛烷胺的MRM模式質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

圖1 樣品中金剛烷胺(A)和D15-金剛烷胺(B)提取離子色譜圖Fig.1 The extracted ion chromatograms of amantadine(A) and D15-amantadine(B) in sample

圖2 金剛烷胺和D15-金剛烷胺的LC-MS/MS質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)式Fig.2 LC-MS/MS mass spectra of amantadine and D15-amantadine

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1檢出限和定量限實驗計算了雞肉中含有100 μg/kg金剛烷胺時的信噪比，檢測限按3倍信噪比時金剛烷胺濃度計算。QuEChERS法和SPE法的檢出限分別為1.0 ng/mL、4.0 ng/mL。在兩種前處理方法中，QuEChERS法作為一個改進(jìn)的萃取方法檢出限更低，而較低的檢出限有利于實驗前樣品的稀釋，更有效地避免基體效應(yīng)。

2.5.2方法線性范圍取金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，分別配制成濃度為2、4、16、32、60、120、240 ng/mL的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，每個濃度都加入同一質(zhì)量的D15-金剛烷胺，并準(zhǔn)確稱量。以檢測到的金剛烷胺與D15-金剛烷胺的峰面積比(Y)和金剛烷胺的濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為：Y=32.76X-2.2570，回歸系數(shù)(R2)為0.9980。實驗表明在2.0～240.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，質(zhì)譜對金剛烷胺具有良好的線性響應(yīng)。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)考察

實驗根據(jù)提取后添加法建立數(shù)學(xué)模型評定基質(zhì)效應(yīng)，可同時考察提取回收率。采用國際上通行的Matuszewski提出的方法，比較不同條件下的峰面積平均值。A組：純的對照品溶液；B組：雞肉空白經(jīng)不同前處理方法提取后添加對照品溶液；C組：雞肉空白中加入混合對照品溶液后經(jīng)不同前處理方法提取。絕對基質(zhì)效應(yīng)：ME=B/A，提取回收率：RE=C/B，方法過程效率：PE=C/A。樣本經(jīng)QuEChERS法和SPE法兩種前處理方法處理后，與高、低濃度混合對照品溶液進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

表2 采用QuEChERS和SPE進(jìn)行樣本前處理時的基質(zhì)效應(yīng)、回收率和過程效率

經(jīng)QuEChERS法和SPE法兩種前處理方法處理后，不同濃度金剛烷胺的ME均大于90%。固相萃取法雖能較強增強LC-MS/MS分析金剛烷胺的離子化效率，但高濃度金剛烷胺的RE小于85%，不符合相關(guān)生物樣本分析方法的規(guī)定，此外方法的PE也很低。與之相比，采用QuEChERS法處理雞肉樣本后，不僅能夠有效增強金剛烷胺離子化效率；同時RE較高且相對穩(wěn)定，其PE也相對較高。綜合考慮方法所耗費的時間以及實驗藥品的消耗，QuEChERS法更適于作為提取雞肉中金剛烷胺的標(biāo)準(zhǔn)方法。

3 結(jié)論

本文在采用LC-MS/MS測定雞肉組織中金剛烷胺化合物時，在同位素稀釋質(zhì)譜法的基礎(chǔ)上比較了QuEChERS法和SPE法兩種前處理方法對基質(zhì)效應(yīng)的影響，從絕對基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率、方法過程效率及方法穩(wěn)定性等方面的考察發(fā)現(xiàn)，采用QuEChERS法對雞肉組織樣本進(jìn)行處理后，LC-MS/MS測定肌肉組織中金剛烷胺化合物的絕對基質(zhì)效應(yīng)大于樣品經(jīng)MCX固相萃取后的絕對基質(zhì)效應(yīng)，表明相對于SPE前處理方法，QuEChERS法能增加金剛烷胺化合物的離子化效率，且該方式下的提取回收率和方法過程效率均較高和穩(wěn)定。因此，針對禽肉中抗病毒藥物金剛烷胺的檢測，QuEChERS法與同位素稀釋質(zhì)譜法結(jié)合能有效降低基質(zhì)效應(yīng)，可以作為禽產(chǎn)品中抗病毒藥物金剛烷胺監(jiān)測以及雞肉粉中金剛烷胺分析基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制時采用的方法。