李媛媛等

摘 要：建立腐竹中堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測定方法。試樣用乙酸銨混合溶液提取，經(jīng)固相萃取小柱凈化，氮氣吹干后用溶解待測。采用LC-MS/MS測定，色譜柱為C18反相色譜柱，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，電噴霧正離子模式電離，多反應(yīng)選擇離子檢測（MRM），基質(zhì)曲線外標(biāo)法定量。結(jié)果表明方法可用于腐竹中堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O的同時測定。

關(guān)鍵詞：腐竹 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜 堿性橙Ⅱ 堿性嫩黃O 多反應(yīng)監(jiān)測 中圖分類號：TS214.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O是一種工業(yè)染料，主要用于家具、紙張、紡織品等的染色，這些染料都有致癌、致畸、致突變性，嚴(yán)重危害人體健康。根據(jù)GB 2760-2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定[1]，這二種物質(zhì)嚴(yán)禁作為食品添加劑使用。由于在中性及偏堿性條件下，堿性橙Ⅱ和堿性嫩黃O與蛋白質(zhì)吸附較牢固，不易褪色，因此有些不法商人就將其用于腐竹的染色，使腐竹的色澤光亮，欺騙消費者，使消費者的身體健康受到嚴(yán)重影響。

本文建立的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）快速準(zhǔn)確地測定腐竹中的堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O的方法，可滿足檢測要求，為食品安全監(jiān)督檢驗提供技術(shù)依據(jù)，對于加強食品監(jiān)管、保障食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1200LC/-6410B MS液相色譜/串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（安捷倫科技有限公司）；BS224S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HYQ-2110液體混勻器（蘇州捷美電子有限公司）；KQ-250DE超聲波發(fā)生器（昆山市超聲儀器有限公司）；Microfuge離心機（美國BECKMAN公司）。

堿性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)品，純度>98%（美國SIGMA公司）；堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)品，純度>98%（美國SIGMA公司）；乙腈、甲酸為色譜純（Burdick&Jackson公司）；無水乙醇（分析純，天津市化學(xué)試劑有限公司）；樣品購自本地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱取堿性嫩黃O、堿性橙Ⅱ 0.005g于50mL容量瓶中，然后用甲醇溶解并稀釋至刻度，于冰箱4℃以下避光保存。用流動相液將堿性嫩黃O、堿性橙Ⅱ儲備液液稀釋成10μg/mL的工作液。

1.2.2 樣品處理和測定

取代表性的樣品，經(jīng)四分法縮減分取25g左右，粉碎并過60目篩，充分混勻后裝入磨口瓶中備用。取混合均勻后的空白樣品，作為空白試樣。

稱取混合均勻試樣1.0g（精確至0.01g）于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入10mL50%甲醇、1%甲酸、50mmol/L乙酸銨水溶液，超聲提取30min，10000r/min離心10min，上清液，過WAX固相萃取柱，收集洗脫液，氮氣吹至近干，用流動相定容至1.0mL，過0.22μm濾膜后液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.3 基質(zhì)加標(biāo)工作曲線的制備

稱取1.0g空白樣品基質(zhì)于50mL離心管中，稱取6份，分別加入標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，按樣品制備方法進(jìn)行操作，制備基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.4 儀器參數(shù)和測定條件

液相色譜條件：C18反相色譜柱（C18 2.1mm×10.0mm id，3.5μm）；柱溫：30℃；流速：0.5mL/min；進(jìn)樣量：5μL；流動相：乙腈-0.2%甲酸水溶液（33+67）。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴霧壓力：35psi；干燥氣流速：8mL/min；離子化溫度：340℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取方法的選擇

堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O為離子型化合物，提取溶液的酸、堿性會影響化合物解離狀態(tài)及與基質(zhì)的結(jié)合力，從而影響提取效率。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道[2-4]，對不同混合溶液的提取效率進(jìn)行實驗，結(jié)果表明甲醇水比例在50%～60%時提取效率最高。為了配合提取后的固相萃取凈化步驟， 本文確定了樣品提取液為含50%甲醇、1%甲酸50mmol/L乙酸銨水溶液。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

不同溶劑對堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O的離子化程度和色譜保留時間有一定的影響。本文選擇了100mm高效液相色譜柱。選擇100mm色譜柱，當(dāng)流動相體系為0.1%甲酸水溶液—乙腈梯度洗脫時，堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O很好地分離。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

堿性橙和堿性嫩黃在溶液中以正離子形式存在。根據(jù)其結(jié)構(gòu)，選擇ESI（+）作為電離方式，將堿性橙和堿性嫩黃分別配制成1.0mg/L的甲醇溶液，通過全掃描方式找出其母離子，采用Product掃描的方式選擇特征離子，逐步加大誘導(dǎo)碰撞能量，隨著母離子的豐度逐漸減少，子離子的豐度逐漸增加，分別選用豐度最大的兩個子離子作為定量和輔助定性離子（見表1），并確定其最佳碰撞能量值，在Product方式中進(jìn)一步調(diào)整碰撞能量，以便獲得最大靈敏度。

2.4 線性范圍與檢出限

基質(zhì)加標(biāo)工作曲線的制備。測定結(jié)果經(jīng)線性回歸，堿性橙Ⅱ回歸方程Y=79.4x+42.7；線性相關(guān)系數(shù)：0.9963。堿性橙Ⅱ回歸方程Y=21.0x-52.6；線性相關(guān)系數(shù)：0.9984。進(jìn)空白樣，以基線3倍噪聲值在標(biāo)準(zhǔn)曲線查得結(jié)果計算，堿性橙Ⅱ檢出限為10μg/kg；堿性嫩黃O檢出限5μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

根據(jù)GB/T 5009.1-2003，我們選取1種空白腐竹粉品，加入2個水平的待測物，按照樣品處理方法及相同的色譜條件下，進(jìn)行回收率的測定，每個樣品重復(fù)3次，計算出每個添加水平的回收率。

3 結(jié)論

本文建立了腐竹中的堿性橙Ⅱ、堿性嫩黃O的高效液相色譜—串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測定方法，該法具有樣品處理簡單、測定周期短等優(yōu)點，適用于大量樣品的快速篩選、測定。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB 2760-2007.食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[2] 趙榕，趙海燕，李兵，吳國華，薛穎.建立同時測定調(diào)味品中非法添加到4種工業(yè)染料的SPE-UPLC-MS/MS[J].中國食品衛(wèi)生學(xué)報，2009（21）：410-414.

[3] 林賽君，屠海云，孫嵐，肖海龍，潘向榮，馬曉燕.高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定食品中五種黃色化工染料[J].色譜，2011（29）：79-82.

[4] 謝維平，歐陽燕玲，黃盈煜，陳春祝.超高效液相色譜同時測定食品中4種工業(yè)染料[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2012（24）：329-332.