李定剛 張鐵 韓旭東 雷思琦 邵譜 郭立佳

摘要 [目的] 為“連葛口服液”的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。[方法] 應(yīng)用“連葛口服液”來(lái)治療人工誘發(fā)的雞大腸桿菌病，并探索“連葛口服液”對(duì)雞濕熱瀉痢證的臨床防治效果。 [結(jié)果] 攻毒試驗(yàn)選用細(xì)菌培養(yǎng)液10-4倍稀釋液，最佳劑量為0.5 ml/只。經(jīng)剖檢和生化試驗(yàn)鑒定為大腸桿菌，通過(guò)血清學(xué)鑒定確定為O₁抗原型。[結(jié)論]“連葛口服液”高、中劑量組對(duì)人工感染雞大腸桿菌病均有良好防治效果，其療效與氟苯尼考相當(dāng)，推薦劑量為1.0 ml/kg體重。

關(guān)鍵詞 連葛口服液；大腸桿菌??；治療

中圖分類號(hào) S853.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）26-09044-03

Treatment Test of “Liange” Oral Liquid on Artificially-induced Chicken Colibacillosis

LI Ding-gang et al

（Baoding Jizhong Pharmaceutical Co.， Ltd.，Baoding， Hebei 071500）

Abstract [Objective] The research aimed to provide scientific basis for large-scale production and application of “Liange” oral liquid. [Method] “Liange” oral liquid was used to treat artificially-induced chicken colibacillosis. The clinical treatment effects of“Liange” oral liquid on chicken dysentery syndrome were investigated. [Result] 10-4 diluted solution of bacterium culture solution was used in virus challenge test and its optimum dose was 0.5 ml/ind.. The bacteria was identified as Escherichia coli by autopsy and biochemical test. And it was confirmed as O₁antigen. [Conclusion] Better prevention and control effects on artificially-induced chicken colibacillosis were obtained in high-dose of“Liange” oral liquid group and medium-dose of“Liange” oral liquid group， and their curative effects were equivalent with florfenicol. And its recommended dose was 1.0 ml per each kilogramme of body weight.

Key words “Liange” oral liquid； Colibacillosis； Treatment

雞大腸桿菌病是由致病性血清型大腸桿菌引起的各種癥候的總稱，不同品種不同日齡的雞均可發(fā)病^[1-2]，其臨床表現(xiàn)多種多樣，如食欲下降、精神沉郁、羽毛松亂、呼吸急促、腹瀉等，剖檢多見肝周炎、心包炎、腹膜炎、氣囊炎、臍炎、眼炎和大腸桿菌肉芽腫等病變^[3]。按照中獸醫(yī)理論類似于濕熱泄瀉，大多由外感暑濕、疫毒之邪，或飲食不潔、濕熱郁結(jié)腸內(nèi)、胃腸受損、運(yùn)化失常、濕熱內(nèi)生，致使氣血阻滯，濕郁熱蒸，腸胃氣化被阻，氣血與暑濕熱毒博結(jié)而造成濕熱泄瀉，治宜燥濕解表，健脾補(bǔ)中，清熱解毒，生津止瀉^[4]。

“連葛口服液”是保定冀中藥業(yè)有限公司根據(jù)此觀點(diǎn)進(jìn)行組方研制而成的新獸藥。該復(fù)方制劑具有較強(qiáng)的清熱解毒、燥濕止痢、活血化瘀、抗菌消炎等作用。筆者應(yīng)用“連葛口服液”來(lái)治療人工誘發(fā)的雞大腸桿菌?。駸釣a痢證模型之一），以驗(yàn)證“連葛口服液”對(duì)雞濕熱瀉痢證的臨床防治效果，以期為其大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

1日齡伊莎褐蛋雞500只，購(gòu)于石家莊金羽祖代雞場(chǎng)。使用不含任何抗菌藥物的雛雞飼料，按照《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部頒布NY/T33-2004 蛋雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》飼養(yǎng)至15日齡。以活潑健康、體重均勻?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，選取90只用于雞大腸桿菌病造模試驗(yàn)，另外300只用于連葛口服液治療試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)藥品與試劑

①連葛口服液，由保定冀中藥業(yè)有限公司中試生產(chǎn)，批號(hào)為100801，主要成分為黃連、黃芩、葛根、甘草、大黃；

②氟苯尼考可溶性粉，購(gòu)于張家港市恒盛藥用化學(xué)有限公司，批號(hào)為FB20090448；

③麥康凱瓊脂，購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司；

④營(yíng)養(yǎng)瓊脂，購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司；

⑤營(yíng)養(yǎng)肉湯，購(gòu)于北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；

⑥細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購(gòu)于杭州天和微生物試劑有限公司；

⑦大腸桿菌O因子診斷血清，購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 試驗(yàn)菌種

雞源大腸桿菌O₁型標(biāo)準(zhǔn)菌株（CVCC249），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種室。

1.4 主要儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱，由北京市永光明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z），由上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-103D），由上海智城分析儀器制造有限公司生產(chǎn)；電子天平（MR200A），由上海第二天平儀器廠生產(chǎn)；超凈工作臺(tái)（LGJ-10），由北京四環(huán)科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 攻毒預(yù)試驗(yàn)。

先將保存的雞大腸桿菌O₁型菌株接種到血瓊脂平板，再挑選典型菌落接種于肉湯中，將分離純化后的肉湯培養(yǎng)液作為攻毒菌。

隨機(jī)選取90只15日齡伊莎褐蛋雞，分為18組，分別以原細(xì)菌培養(yǎng)液及其10-1倍稀釋液、10-2倍稀釋液、10-3倍稀釋液、10-4倍稀釋液、10-5倍稀釋液稀釋液為攻毒液，胸部肌肉注射攻毒，每個(gè)稀釋度分成1.00、0.50、0.25 ml 3個(gè)劑量，接種后觀察各組試驗(yàn)雞的精神、采食、飲水、糞便和呼吸等臨床情況；對(duì)死亡雞進(jìn)行病理剖檢，取肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。觀察48 h后記錄死亡情況。以半數(shù)致死量作為攻毒劑量。

1.5.2 治療試驗(yàn)。

1.5.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理。

將300只雛雞隨機(jī)分為6組，每組50羽，待穩(wěn)定后進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定攻毒菌液稀釋濃度和劑量，除陰性對(duì)照組以外，每組雞胸肌注射該劑量的雞大腸桿菌O₁菌液。攻毒后，觀察各陽(yáng)性對(duì)照組雞的精神、采食、飲水、呼吸、糞便等臨床表現(xiàn)，待出現(xiàn)典型濕熱泄瀉癥候（精神萎靡不振、羽毛蓬亂、離群呆立、食欲廢絕、腹瀉、糞便呈黃綠色水便）時(shí)開始混飲用藥。其中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組用連芩止瀉口服液治療，分別以高劑量（Ⅰ組，1.5 ml/kg體重）、中劑量（Ⅱ組，1.0 ml/kg體重）和低劑量（Ⅲ組，0.5 ml/kg體重）飲水給藥；Ⅳ組為藥物對(duì)照組，用氟苯尼考可溶性粉（20 mg/kg體重）混飲；Ⅴ組為陽(yáng)性對(duì)照組，攻毒不給藥；Ⅵ組為陰性對(duì)照組，不攻毒不給藥。藥物治療組連續(xù)用藥5 d，各組存活雞第7天全部撲殺。試驗(yàn)動(dòng)物分組及處理見表1。

試驗(yàn)期間，每天定時(shí)觀察并記錄試驗(yàn)雞的臨床癥狀變化、死亡和增重情況，對(duì)死雞進(jìn)行病理剖檢和細(xì)菌分離、生化鑒定、O抗原測(cè)定。計(jì)算各組的保護(hù)率、治愈率、死亡率，于接種細(xì)菌前和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別稱量各組雞的體重，計(jì)算相對(duì)增重率，并對(duì)各組間的上述指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.2.2 療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。

①死亡率。凡在試驗(yàn)期間出現(xiàn)雞大腸桿菌病的典型濕熱泄瀉證（精神萎靡不振，羽毛蓬亂，離群呆立，食欲廢絕，糞便呈黃綠色水便，少數(shù)糞便帶血）并死亡；尸體剖檢心臟、肝臟等有典型病變特征；并從肝臟、脾臟及腸系膜淋巴結(jié)中分離出大腸桿菌，判為死亡，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組死亡雞只數(shù)占該組試驗(yàn)雞數(shù)的百分率為死亡率；

②保護(hù)率。用藥后，濕熱泄瀉癥侯有所緩解或痊愈均為保護(hù)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組存活雞只數(shù)占該組試驗(yàn)雞數(shù)的百分率為保護(hù)率；

③治愈率。試驗(yàn)期間，雞經(jīng)混飲給藥后，精神狀態(tài)、食欲和飲水恢復(fù)正常，體重增加，不再出現(xiàn)腹瀉等臨床癥狀，經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)無(wú)任何病變視為治愈。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)每組治愈雞只數(shù)占該組試驗(yàn)雞數(shù)的百分率為治愈率；

④相對(duì)增重率。試驗(yàn)期間各試驗(yàn)組增重占陰性對(duì)照組增重的百分比。陰性對(duì)照組增重設(shè)為100%。

1.6 數(shù)據(jù)處理

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，其中死亡率、保護(hù)率及治愈率采用χ2檢驗(yàn)；增重采用t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 攻毒預(yù)試驗(yàn)

人工感染大腸桿菌約8 h后，各試驗(yàn)組雞均出現(xiàn)不同程度的雞大腸桿菌病典型癥狀：精神不振、腹瀉、眼結(jié)膜潮紅、食欲減退至廢絕等；12 h后開始出現(xiàn)死亡，從病死雞肝臟可分離到細(xì)菌，經(jīng)生化鑒定為大腸桿菌。攻毒雞的死亡情況見表2。

在建立動(dòng)物疾病模型時(shí)應(yīng)選擇適宜的攻毒液濃度和用量，盡量達(dá)到動(dòng)物發(fā)病但不死亡的理想效果。該試驗(yàn)選擇半數(shù)致死量作為攻毒的最佳劑量。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選用攻毒濃度為細(xì)菌培養(yǎng)液10-4倍稀釋液，劑量為0.5 ml/只。

2.2 治療試驗(yàn)

2.2.1 臨床癥狀及死亡情況。

除陰性對(duì)照組外其他各組雛雞在攻毒約8 h后陸續(xù)發(fā)病，出現(xiàn)不同程度的雞大腸桿菌病的典型癥狀（濕熱泄瀉證的證侯），主要表現(xiàn)為精神不振、羽毛松亂、兩翼下垂、頭頸縮入、閉眼昏睡、不愿走動(dòng)、離群呆立、不同程度的腹瀉、眼結(jié)膜潮紅、食欲減退，嚴(yán)重者食欲廢絕、臥地不起等。

陽(yáng)性對(duì)照組在攻毒12 h開始出現(xiàn)死亡，24～48 h達(dá)到高峰，此后數(shù)天內(nèi)仍有雞陸續(xù)死亡，全組大部分動(dòng)物在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中精神不振，食欲減少，拉白色稀糞。連葛口服液低劑量治療組的動(dòng)物在24～48 h內(nèi)死亡較多，但隨后的觀察中沒有再出現(xiàn)死亡，雞精神較好，采食飲水略差，多數(shù)在第7天以后基本正常。中劑量、高劑量和氟苯尼考治療組的動(dòng)物在攻毒后也出現(xiàn)死亡，但死亡動(dòng)物數(shù)量較少，72 h以后開始恢復(fù)，至試驗(yàn)結(jié)束大多數(shù)雞只精神、飲食恢復(fù)正常。各試驗(yàn)組在攻毒后144 h均沒有再出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。陰性對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中精神狀態(tài)、食欲飲水正常，沒有出現(xiàn)動(dòng)物死亡現(xiàn)象。雞死亡情況具體見表3。

2.2.2 剖檢病變。

剖檢病死雞出現(xiàn)雞大腸桿菌病的典型病變：氣管黏液增多，肝臟大多有散在的出血點(diǎn)，病程稍長(zhǎng)的表現(xiàn)出典型纖維素性心包炎、肝周炎變化，同時(shí)伴有腸粘膜肥厚，腸腔有多量黃色泡沫，腎臟稍腫。

2.2.3 分離菌株的鑒定。

從病死雞肝臟可分離到細(xì)菌，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢可見紅色陰性小桿菌，多數(shù)單個(gè)散在，個(gè)別成雙排列，兩端鈍圓，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，符合大腸桿菌的形象特征。經(jīng)生化試驗(yàn)鑒定為大腸桿菌（表4），血清學(xué)鑒定O抗原型為O₁。

2.2.4 藥物治療效果。由表5可知，飲水給藥7 d后4個(gè)藥物治療組（“連葛口服液”高、中、低劑量組以及氟苯尼考組）雞的死亡率、治愈率、保護(hù)率和相對(duì)增重率與陽(yáng)性對(duì)照組差異均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。因此，臨床試驗(yàn)結(jié)果表明不同劑量“連葛口服液”及氟苯尼考對(duì)人工感染雞大腸桿菌病均有一定的防治效果。

“連葛口服液”低劑量組在治愈率和相對(duì)增重率方面與氟苯尼考組差異顯著（P<0.05），說(shuō)明低劑量的“連葛口服液”對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的防治效果不佳，不及氟苯尼考；“連葛口服液”高、中劑量組與氟苯尼考組相比，死亡率、治愈率、保護(hù)率、相對(duì)增重率方面均差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明高、中劑量的連葛口服液對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的防治效果與氟苯尼考相當(dāng)；“連葛口服液”高、中劑量組各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著（P>0.05），表明對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的防治效果無(wú)顯著差異。

綜上所述，“連葛口服液”高、中劑量組對(duì)人工感染雞大腸桿菌病的防治效果良好，與氟苯尼考療效相當(dāng)。高、中劑量“連葛口服液”組各指標(biāo)均無(wú)顯著性差異，因此以中劑量為推薦劑量。

3 討論

3.1 雞大腸桿菌病的治療藥物

雞大腸桿菌病是雞的一種常見傳染病，目前該病的防治多以使用抗菌的化學(xué)藥物為主，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，大腸桿菌對(duì)抗菌的化學(xué)藥物的耐藥性問(wèn)題越來(lái)越突出。另外，畜產(chǎn)品無(wú)公害化生產(chǎn)的要求使抗生素的選擇范圍越來(lái)越小。中藥治療效果受菌株耐藥性的影響較小，且毒性小、副作用小、幾乎無(wú)殘留，所以研究應(yīng)用中藥防治雞大腸桿菌病具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

3.2 雞大腸桿菌病辯證施治

雞大腸桿菌病按中獸醫(yī)理論類屬于濕熱壅積腸道的里熱證、泄瀉證，大多由外感暑濕、疫毒之邪，或飲食不潔，濕熱郁結(jié)腸內(nèi)，胃腸受損，運(yùn)化失常，濕熱內(nèi)生，致使氣血阻滯，濕郁熱蒸，腸胃氣化被阻，氣血與暑濕熱毒博結(jié)，造成濕熱泄瀉，治宜健脾補(bǔ)中，清熱解毒，燥濕止痢?！斑B葛口服液”正是根據(jù)此觀點(diǎn)進(jìn)行組方，所組的復(fù)方制劑具有較強(qiáng)的清熱解毒和殺菌作用，還能綜合調(diào)理機(jī)體的各種生物機(jī)能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

3.3 連葛口服液對(duì)雞大腸桿菌病的療效作用

“連葛口服液”是由經(jīng)典中藥方劑“葛根芩連湯”改良而成的具有清熱解毒、燥濕止痢、活血化瘀、抗菌消炎等作用的新型中草藥制劑，由黃連、黃芩、葛根、甘草、大黃5味藥組成，以黃連為君藥，取其大苦能燥濕、大寒可瀉熱之功，發(fā)揮清熱解毒、燥濕止痢的作用；以黃芩、葛根同為臣藥，黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒之功，葛根退熱生津、升陽(yáng)止瀉，二者共助黃連清熱解毒、燥濕止瀉之功；以炙甘草為佐藥，補(bǔ)脾益氣，使君臣藥物攻而不致傷正、補(bǔ)亦不致助邪；以大黃為使藥，既可增強(qiáng)君臣藥物燥濕解毒之功，又能活血化瘀、通腸瀉熱、推陳出新、快速排出毒素，同時(shí)引諸藥入脾、胃、大腸經(jīng)。諸藥同用，共奏清熱燥濕、通腸排毒之功。因此，對(duì)由大腸桿菌引起的濕熱壅積腸道的“濕熱瀉痢證候”模型具有較好的治療作用。

“連葛口服液”采用飲水給藥，這種給藥方式比混料更加方便，同時(shí)雞只發(fā)病時(shí)往往引起采食量下降，但飲水量下降不明顯，因此飲水給藥能保證雞體內(nèi)藥物的有效濃度，從而達(dá)到較好的療效。

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