曲忠誠(chéng)

摘要 選用生產(chǎn)上應(yīng)用的5個(gè)大豆品種為材料，利用分布在16個(gè)基因連鎖群的多態(tài)性SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行帶型分析。供試材料通過(guò)分子鑒定，均存在混雜現(xiàn)象，去除混雜株行后，將帶型一致的株行進(jìn)行繁殖，從而獲得純度較高的原原種。研究結(jié)果表明，利用SSR分子標(biāo)記對(duì)大豆原原種進(jìn)行提純，不僅能夠去除形態(tài)學(xué)上的差異種子，還能夠?qū)⑿螒B(tài)特點(diǎn)極為相似的混雜種子去除。

關(guān)鍵詞 分子標(biāo)記；大豆；原原種；提純

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）26-08887-03

Application of SSR Markers in Soybean Original Seed Purification

QU Zhong-cheng

（Qiqihaer Sub-academy of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Qiqihaer， Heilongjiang 161006）

Abstract This study selected 5 soybean varieties used in production as material， using PCR amplified polymorphic SSR primers distributed on 16 linkage groups， through 6% polyacrylamide gel electrophoresis， for banding analysis. The tested materials by molecular identification， there are mixed phenomenon， after removal of hybrid lines， the type of strains was reproduced， so as to obtain higher purity of the original seed. The results show that， the soybean seed was purified by using SSR molecular markers， not only can remove the difference of morphology on the seed， but also can remove other similar hybrid seeds.

Key words Molecular markers； Soybean； Pre-elite seed； Purification

從20世紀(jì)50年代開始，經(jīng)過(guò)我國(guó)育種家的不懈努力，累積育成、推廣大豆新品種1 500多個(gè)^[1]，這些新育成的大豆品種具有相對(duì)穩(wěn)定的形態(tài)特征和生理特性，但經(jīng)過(guò)一代代的生產(chǎn)繁殖，大部分大豆品種都會(huì)逐漸發(fā)生純度降低、種性變劣等不良變異，因而導(dǎo)致一些品種失去了原本具有的形態(tài)特點(diǎn)和生理特性，抗逆性、產(chǎn)量和品質(zhì)不斷下降，并有混雜現(xiàn)象。這種混雜是在大豆生產(chǎn)繁殖過(guò)程中普遍存在的現(xiàn)象，育種家或種子生產(chǎn)者為防止品種混雜退化，通常會(huì)進(jìn)行原原種繁殖，以便去除混雜植株?？梢娫N提純是大豆種子生產(chǎn)、繁殖過(guò)程中一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，育種家及種子生產(chǎn)者通常做法是分辨原原種株行形態(tài)學(xué)上的差異來(lái)去除雜株，但這不僅無(wú)法去除形態(tài)特點(diǎn)極為相似的混雜種子，并費(fèi)時(shí)費(fèi)工，且受環(huán)境條件影響較大。隨著DNA分子標(biāo)記和檢測(cè)技術(shù)的日趨完善，利用SSR為共顯性分子標(biāo)記的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定不同大豆品種基因型^[2-4]。

目前，利用SSR標(biāo)記鑒定雜交種純度已廣泛用于玉米、水稻、油菜、棉花、番茄等作物中，佘花娣等^[5]闡述了利用 DNA指紋技術(shù)進(jìn)行品種鑒定的原理、特點(diǎn)及其研究概況，認(rèn)為DNA指紋技術(shù)可以鑒定表型上難于鑒別的作物品種^[6]。該標(biāo)記具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富、簡(jiǎn)便快速、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，能夠反映DNA水平上品種個(gè)體間的遺傳差異。該技術(shù)是純度種子鑒定的最適宜技術(shù)之一，可廣泛應(yīng)用于植物分子標(biāo)記連鎖圖的構(gòu)建與基因定位、遺傳關(guān)系分析、種質(zhì)及其純度鑒定等方面。

針對(duì)育種和原原種繁殖過(guò)程中，種子提純不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)工，且無(wú)法去除混雜形態(tài)相似種子的現(xiàn)象，筆者主要通過(guò)材料間廣泛多態(tài)性的SSR引物，對(duì)原原種單株進(jìn)行分子檢測(cè)，去除混雜單株，以達(dá)到原原種提純的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用5份參試的大豆品種500個(gè)株行進(jìn)行分析，分別設(shè)代號(hào)A、B、C、D和E，均為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊齊哈爾分院提供。田間收獲時(shí)，每份材料選取100株單株，每株單獨(dú)脫粒，單獨(dú)存放并編號(hào)為A001、A002…等，以此類推。

1.2 方法

1.2.1 總DNA 提取與SSR分析。

參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)大豆品種純度鑒定技術(shù)規(guī)程分子標(biāo)記法（NY/T 1788-2009）進(jìn)行分析。每份材料取100粒種子，每粒種子編號(hào)，反臍方向取等量組織混合制樣。試驗(yàn)取少量放入1.5 ml離心管中，加入700 μl預(yù)熱（60 ℃）的SDS提取液倒置幾次，在60 ℃下水浴60 min，中間顛倒混勻3次。取出后在室溫下10 000 r/min離心15 min，加700 μl 24∶1（V/V）的氯仿∶酚溶液，倒置幾次輕輕混勻，室溫下10 000 r/min離心15 min。去上清液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，加入700 μl 24∶1（V/V）氯仿∶酚重新抽提一次，室溫下8 000 r/min離心15 min。加700 μl異丙醇（-20 ℃）靜置15 min，8 000 r/min離心5 min去上清。用75%乙醇洗滌沉淀2次，吹干后用200 μl超純水溶解。采用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA濃度。

1.2.2 SSR引物來(lái)源。

根據(jù)Cregan大豆公共遺傳圖譜，分別在20條染色體連鎖群上隨機(jī)選擇覆蓋全基因組的SSR引物，經(jīng)篩選選取16個(gè)連鎖群上擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性高的15對(duì)SSR引物進(jìn)行試驗(yàn)，采用上海生物工程有限公司合成的SSR引物序列。

1.2.3 SSR引物篩選及擴(kuò)增。

利用篩選的15對(duì)引物，對(duì)5組共500份材料進(jìn)行SSR分子標(biāo)記分析。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系含1×的PCR緩沖液，150 μmol/L引物（包括上游引物和下游引物），250 μmol/L dNTPs，150 μl 10×buffer，1 U Taq聚合酶，30 ng總DNA，用超純水補(bǔ)足15 μl。

PCR反應(yīng)在T-Gradient進(jìn)行，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，47 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，于4 ℃下保存。

電泳方法：每個(gè)SSR體系加1.5 μl甲酰胺雙色Loading Buffer（在PCR板上），置于PCR儀中變性5 min，然后放入冰水混合物中冷卻。PCR產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序膠上分離，采用北京六一廠DYIII-88A型電泳槽，功率為恒定100 W，電泳時(shí)長(zhǎng)約1 h。

銀染方法：0.2% AgNO₃中染色20 min（避光），去離子水漂洗30 s，用10%冰醋酸固定液定影5 min，清水漂洗2 min，照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記的多態(tài)性分析

利用篩選的15對(duì)引物對(duì)全部材料進(jìn)行分子標(biāo)記擴(kuò)增，獲得清晰的電泳譜帶。品種B 100份株行中，B1～B50樣本中Satt503位點(diǎn)存在差異的電泳譜帶見圖1，共有5個(gè)株行存在差異。B51～B100樣本中Satt503位點(diǎn)無(wú)差異。

3 討論

大豆在育種和繁殖過(guò)程中，利用種子或植株的外觀特性來(lái)鑒別不同個(gè)體的方法雖然較直觀、簡(jiǎn)便，但可直接觀測(cè)的農(nóng)藝性狀有限，且受外界環(huán)境的影響較大，不利于種子繁殖和提純工作的開展。隨著分子生物學(xué)應(yīng)用的日趨廣泛，利用分子標(biāo)記技術(shù)在種子純度鑒定方面的研究結(jié)果表明，SSR是一種可用于種子純度鑒定的簡(jiǎn)便技術(shù)。

該研究選用多態(tài)性指數(shù)較高的15對(duì)SSR引物進(jìn)行電泳擴(kuò)增，對(duì)大豆原原種進(jìn)行提純，不僅能夠去除形態(tài)學(xué)上有差異的種子，還能夠?qū)⑿螒B(tài)特點(diǎn)極為相似的混雜種子去除。隨著更多SSR位點(diǎn)的開發(fā)及SSR檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步與普及，這一技術(shù)將在原原種提純中得到廣泛應(yīng)用。

4 結(jié)論

該研究選用篩選出株行間具有多態(tài)性的SSR引物對(duì)5個(gè)生產(chǎn)上應(yīng)用的大豆品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行帶型分析，獲得原原種的純度，并將帶型一致的株行進(jìn)行繁殖，從而獲得純度較高的原原種。結(jié)果表明，供試品種均存在混雜現(xiàn)象，利用SSR分子標(biāo)記去除混雜單株，不僅能夠去除形態(tài)學(xué)上有差異的種子，還能夠?qū)⑿螒B(tài)特點(diǎn)極為相似的混雜種子去除。該方法檢測(cè)快速，不受環(huán)境影響，且省時(shí)省力。

參考文獻(xiàn)

[1] GAO Y L，ZHU R S，LIU C Y，et al.Establishment of Molecular ID in Soybean Varieties in Heilongjiang，China[J].Acta Agron Sin，2009，35（2）：211-218.

[2] 張芳，謝皓，陳學(xué)珍.大豆分子標(biāo)記輔助育種研究進(jìn)展[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25（2）：73-77.

[3] RUSSELL J R，F(xiàn)ULLER J D，MACAULAU M，et al.Direct Comparison of levels of genetic variation among barley accessions detected by RFLPs，AFLPs，SSRs and RAPDs[J].Theor Appl Genet，1997，9：714-722.

[4] POWELL W M，MORGANTE J J，DOYLE J W，et al.Genepool variation in genus Glycine subgenus soja revealed by polymer phicnuclear and chloroplast microsatellites[J].Genetics，1996，144：793-803.

[5] RUSSELL J R，F(xiàn)ULLER J D，MACAULAU M，et al.Powell W，Waugh R.Direct Comparison of levels of genetic variation among barley accessions detected by RFLPs，AFLPs，SSRs and RAPDs[J].Theor Appl Genet，1997，9：714-722.

[6] SHE H D，CHEN J T，HUANG Y Q，et al.Progress on variety identification of crop using DNA fingerprinting[J].J Agric Univ Hebei，2003，26（S1）：28-32.