黃建韶　張洪

摘要[目的]研究Alcalase蛋白酶對(duì)大米蛋白的水解作用以改善大米蛋白的溶解性。[方法]通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究pH、溫度、酶濃度、底物濃度等因素對(duì)Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的影響，通過(guò)正交試驗(yàn)確定Alcalase蛋白酶水解大米蛋白的最佳水解條件。[結(jié)果] Alcalase蛋白酶水解大米蛋白的最佳水解條件是pH 8.0、溫度55 ℃、酶濃度1 200 U/g、底物濃度4%、水解時(shí)間2 h，此條件下大米蛋白的溶解度為71.25%。[結(jié)論]酶解后大米蛋白的溶解度顯著提高。

關(guān)鍵詞大米蛋白；堿性蛋白酶；酶解；溶解度

中圖分類(lèi)號(hào)S609.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）28-09933-03

Study on Solubility Improvement of Rice Protein

HUANG Jianshao， ZHANG Hong

（School of Life Science， Hunan University of Arts and Science， Changde， Hunan 415000）

Abstract[Objective] In order to improve the solubility of rice protein， hydrolysis process for rice protein with Alcalase was studied. [Method] The effects of the main parameters including pH， hydrolysis temperature， enzyme concentration， substrate concentration， hydrolysis time on hydrolysis reaction were investigated. The optimum conditions had been found by singlefactor analysis and orthogonal test. [Result] The optimum conditions were showed as following， pH was 8.0， hydrolysing temperature was 55 ℃， enzyme concentration of substrate was 1 200 U/g， substrate concentration was 4%， hydrolysis time was 2 h， solubility of rice protein was 71.25%. [Conclusion] After enzymatic hydrolysis， the solubility of rice protein increased significantly.

Key wordsRice protein； Alcalase； Enzymatic hydrolysis； Solubility

大米蛋白是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白，它含有豐富的必需氨基酸，第1限制性氨基酸賴氨酸的含量高于其他谷類(lèi)，且氨基酸組成模式與WHO/FAO的推薦模式相接近，易于被人體消化吸收。與其他谷類(lèi)蛋白相比，大米蛋白的生物價(jià)（BV）和蛋白質(zhì)利用率（PER）更高，在各種糧食中均居第1位。大米蛋白還具有低過(guò)敏性的特點(diǎn)，這使它非常適合作為嬰兒或是特殊人群的蛋白補(bǔ)充劑[1]。但大米蛋白主要成分是谷蛋白，谷蛋白分子量大，分子內(nèi)和分子之間大量存在巰基和二硫鍵，這些結(jié)構(gòu)特性使得大米蛋白在中性條件下難溶于水，嚴(yán)重影響它在食品工業(yè)中的應(yīng)用，因此改善大米蛋白的溶解性是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵[2]。蛋白酶是具有生物催化功能的生物大分子，能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分子的肽鏈水解斷裂，改善蛋白質(zhì)的溶解性。

筆者采用淀粉糖生產(chǎn)的下腳料米渣用淀粉酶純化制得大米蛋白，采用Alcalase蛋白酶進(jìn)行酶解試驗(yàn)，研究酶用量、底物濃度、pH、溫度等因素對(duì)大米蛋白溶解性的影響，確定Alcalase蛋白酶水解大米蛋白的工藝條件，以期改善大米蛋白的溶解性。

1材料與方法

1.1材料

米渣蛋白，由萬(wàn)福生科農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)股份有限公司提供（蛋白質(zhì)含量為52.5%、總糖含量為32.1%、水分含量為6.5%）。主要試劑：中溫α淀粉酶（10 000 U/g）、Alcalase蛋白酶（200 000 U/g），江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；福林酚試劑，上海荔達(dá)生物科技有限公司；酪蛋白（AR），杭州微生物試劑廠；氫氧化鈉、鹽酸等試劑均為分析純。

儀器與設(shè)備：

722S紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；凱氏定氮儀，長(zhǎng)沙隆和化波儀器有限公司；H.H.S.21電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠；TDL40B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；ES電子計(jì)數(shù)天平，長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司；TB3型定時(shí)恒溫磁力攪拌器，上海雷磁新經(jīng)儀器有限公司；DELTA320pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1測(cè)定項(xiàng)目及方法。大米蛋白和酪蛋白的蛋白質(zhì)含量測(cè)定：凱氏定氮法；

可溶性氮的測(cè)定：福林酚法[3]。

1.2.2大米蛋白的制備。

采用淀粉酶脫糖法提純制得大米蛋白。酶解條件是：固液比1∶12 g/ml、溫度70 ℃、pH 6.5、加酶量30 U/g、酶解時(shí)間3 h。反應(yīng)結(jié)束后酶解液調(diào)pH至4.0，沉淀物真空干燥、粉碎制得大米蛋白粉。采用淀粉酶脫糖制得的大米蛋白的蛋白質(zhì)含量83.2%。

1.2.3大米蛋白的酶解反應(yīng)。

配制一定濃度的大米蛋白懸浮液，調(diào)溫度、pH至試驗(yàn)設(shè)定值，加入反應(yīng)所需的酶量，并低速攪拌。在反應(yīng)過(guò)程中以1.0 mol/L的NaOH維持pH恒定（±0.1 pH單位）。水解結(jié)束后立即把酶解液放入95 ℃熱水中加熱15 min終止反應(yīng)，酶解液冷卻后用1.0 mol/L HCl溶液或NaOH溶液調(diào)pH至7.0，在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，用福林酚法測(cè)定上清液可溶性蛋白質(zhì)含量，計(jì)算大米蛋白酶解產(chǎn)物的溶解度[4-5]。

溶解度（%）=上清液可溶性蛋白質(zhì)總量/反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)總量×100

2結(jié)果與分析

2.1Alcalase蛋白酶濃度對(duì)大米蛋白溶解度的影響

酶解條件：溫度50 ℃、pH 8.0、底物濃度[S]8%、酶解時(shí)間2.0 h，以酶解液的溶解度為指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著酶濃度的增加，大米蛋白酶解液的溶解度快速增加，但酶濃度大于1 200 U/g 后，溶解度的增速顯著減慢，這是因?yàn)樵诿概c底物作用位點(diǎn)達(dá)到飽和的情況下，加大酶的濃度對(duì)于酶解反應(yīng)速度的影響有限?？紤]到酶解效果，Alcalase蛋白酶的酶濃度選擇1 200 U/g底物較為適宜。

圖1Alcalase蛋白酶濃度對(duì)大米蛋白溶解度的影響

2.2大米蛋白底物濃度對(duì)大米蛋白溶解度的影響

酶解條件：溫度50 ℃、pH 8.0、酶用量1 200 U/g、酶解時(shí)間2.0 h，以酶解液的溶解度為指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖2。在底物濃度較低時(shí)，大米蛋白酶解液的溶解度較高，當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)6%以后，大米蛋白酶解液的溶解度顯著下降，其原因可能是底物濃度增大后，不利于酶與底物的充分接觸。因此，底物濃度在4%～6%較為適宜。

圖2大米蛋白底物濃度對(duì)大米蛋白溶解度的影響

2.3酶解pH對(duì)大米蛋白溶解度的影響

酶解條件：溫度50 ℃、酶用量1 200 U/g、底物濃度[S]8%、時(shí)間2.0 h，以大米蛋白酶解液的溶解度為指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖3。Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白最適pH在7.0～9.0。

圖3pH對(duì)大米蛋白酶水解產(chǎn)物溶解度的影響

2.4酶解溫度對(duì)大米蛋白溶解度的影響

酶解條件：pH 8.0、酶用量1 200 U/g、底物濃度[S]8%、時(shí)間2.0 h，以大米蛋白酶解液的溶解度為指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖4。在酶解溫度為45～55 ℃，大米蛋白的溶解度隨溫度的升高而增大；但溫度高于60 ℃后，溶解度迅速下降。因此，Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的最適溫度在50～60 ℃。

圖4溫度對(duì)大米蛋白酶水解產(chǎn)物的影響

2.5Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白最佳條件的確定

采用L9（34）正交表，以大米蛋白酶解液的溶解度指標(biāo)，擬定試驗(yàn)方案（表1）來(lái)考慮4個(gè)因素對(duì)水解度的影響，水解時(shí)間為2 h。

由正交試驗(yàn)結(jié)果表2可知，影響大米蛋白酶解產(chǎn)物溶解度的4個(gè)因素中，其影響程度大小為A>B>C> D，最優(yōu)組合為A1B3C3D2，即Alcalase蛋白酶濃度為1 200 U/g，大米蛋白用量4.0%，酶解溫度為55 ℃，酶解pH為8.0。在此條件下酶解2 h，大米蛋白酶解產(chǎn)物的溶解度為71.25%，而從表2中直觀看出的最大溶解度為70.21%，故確定Alcalase酶解大米蛋白的最佳條件是Alcalase蛋白酶濃度為1 200 U/g，大米蛋白底物濃度4.0%，溫度為55 ℃，pH為8.0。

2.6Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的水解曲線

影響大米蛋白酶解液溶解度的另一重要因素是酶解時(shí)間。在pH為8.0，溫度為55 ℃，酶濃度為1 200 U/g，底物濃度為4.0%的條件下，測(cè)定Alcalase蛋白酶的水解曲線，以確定適宜的酶解時(shí)間。由圖5可知，Alcalase蛋白酶對(duì)大米蛋白酶解效率高，30 min酶解液的溶解度就達(dá)57.68%，而2 h以后溶解度的增幅很小。綜合考慮，Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的時(shí)間在2 h較為適宜。

圖5Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白的水解曲線

2.7pH對(duì)大米蛋白酶解液溶解度的影響酶解結(jié)束后，調(diào)節(jié)酶解液的pH，測(cè)定不同pH條件下溶解度的變化。從圖6可知，大米蛋白用Alcalase蛋白酶酶解2 h后，溶解度大幅增加，特別是在等電點(diǎn)區(qū)域（pH 4）尤為顯著。酶解前大米蛋白在pH 4時(shí)的溶解度僅為8.31%，而酶解后溶解度增至66.87%，溶解性能的改善將有助于拓展大米蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域。

3結(jié)論

采用Alcalase蛋白酶酶解大米蛋白，能有效改善大米蛋

白的溶解性。Alcalase蛋白酶水解大米蛋白的最佳條件是

圖6pH對(duì)大米蛋白酶解液溶解度的影響

pH 8.0，溫度55 ℃，酶濃度為1 200 U/g，底物濃度為4.0%，水解時(shí)間2 h，大米蛋白酶解液的溶解度達(dá)71.25%。

大米蛋白酶解后，溶解性顯著改善，即使在大米蛋白的等電點(diǎn)區(qū)域仍然有很好的溶解度。

參考文獻(xiàn)

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