姚良同　魏瑋　張建軍　賈樂

摘要[目的] 探索滑菇Pholiota nameko SW01菌株產(chǎn)漆酶的最佳營養(yǎng)條件及其酶學(xué)性質(zhì)。[方法] 首先選取不同的碳源、氮源、pH、金屬離子進(jìn)行單因素試驗(yàn)，得到最佳培養(yǎng)基成分，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析。在酶學(xué)性質(zhì)試驗(yàn)中，設(shè)置不同溫度及pH，測定漆酶的最適反應(yīng)溫度、pH及熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性。[結(jié)果] 最適的碳源和氮源分別為葡萄糖和蛋白胨，最適pH為5，Cu2+能顯著提高漆酶的產(chǎn)量。響應(yīng)面分析結(jié)果表明，最佳的產(chǎn)漆酶條件為葡萄糖42.50 g/L，蛋白胨2.10 g/L，pH 5.47，Cu2+濃度1.67 mmol/L，在此條件下漆酶活性為943.27 U。在酶學(xué)性質(zhì)試驗(yàn)中，漆酶的最適反應(yīng)溫度為30 ℃，最適反應(yīng)pH為4.8。[結(jié)論] 條件優(yōu)化能顯著提高滑菇漆酶產(chǎn)量。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，漆酶對溫度較敏感，對pH反應(yīng)不敏感，在弱酸環(huán)境中能發(fā)揮較高的活性。

關(guān)鍵詞漆酶；漆酶性質(zhì)；優(yōu)化；Pholiota nameko SW01

中圖分類號S509.9文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）04-00969-03

基金項(xiàng)目山東省食用菌產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目。

作者簡介姚良同（1964-），男，山東泰安人，高級實(shí)驗(yàn)師，從事食藥用真菌方面的研究。*通訊作者，教授，從事食藥用真菌方面的研究。

滑菇（Pholiota nameko）又名光帽黃傘、光帽鱗傘、珍珠菇等，屬于擔(dān)子菌綱、傘菌目、絲膜菌科、鱗傘屬?；胶胸S富的營養(yǎng)物質(zhì)，其食用、藥用價(jià)值受到越來越多消費(fèi)者的青睞。它還是一種具有木質(zhì)素降解能力的木腐菌，其降解木質(zhì)素的能力主要取決于一些以木質(zhì)素為底物的酶類，如漆酶、多酚氧化酶和愈創(chuàng)木酚氧化酶活力等，并且漆酶在木質(zhì)素降解中發(fā)揮中重要的作用。

漆酶（laccase，EC 1. 10. 3. 2）是銅藍(lán)氧化酶家族中的一種多酚氧化酶。按照來源，可分為漆樹漆酶（Rhus laccase）和真菌漆酶（Fungal laccase）。現(xiàn)在，用于漆酶生產(chǎn)的主要是一些高等真菌，其中擔(dān)子菌亞門的白腐真菌產(chǎn)漆酶能力較強(qiáng)[1]。漆酶的底物非常廣泛，主要是酚類化合物、芳胺類、芳香羧酸類、甾體激素及生物色素、金屬有機(jī)化合物等[2-3]。因此，漆酶在木質(zhì)素降解、環(huán)境保護(hù)、造紙工業(yè)、食品工業(yè)等領(lǐng)域具有很大的研究價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。另外，利用漆酶進(jìn)行藥物的修飾加工、功能高分子材料的合成也是近年來研究的熱點(diǎn)之一[4]。

筆者優(yōu)化了滑菇SW01菌株產(chǎn)漆酶的營養(yǎng)條件，測定了滑菇在不同條件下生長過程中漆酶活力的變化，并且對漆酶作用的最適條件、漆酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性作了初步研究，為研究滑菇降解木質(zhì)素的生物作用提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1滑菇（Pholiota nameko SW01）。由實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑。所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純，購買于當(dāng)?shù)卦噭┕尽?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯20.00%，葡萄糖2.00%，KH2PO4 0.15%，MgSO4 0.10%，瓊脂2.00%；液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20.00%，蛋白胨2.50%，KH2PO4 0.15%，MgSO4 0.10%。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1滑菇液體培養(yǎng)及粗酶液的制備。將100 ml PDA液體培養(yǎng)基裝入250 ml三角瓶中，滅菌后接入直徑為5 mm的菌種，25 ℃，150 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)。10 d后取發(fā)酵液，5 ℃，3 600 r/min離心15 min。上清液即為粗酶液。

1.2.2 漆酶活力的測定[5]。向試管中加入3.36 mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺溶液（用濃度95%乙醇溶解）0.5 ml，再加入0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 4.6）3.5 ml、酶液1 ml，混勻，30 ℃水浴，保溫30 min，可見分光光度計(jì)測600 nm處得OD值。酶活單位1 U=△OD/（30 min· ml）發(fā)酵液。取1 ml酶液，沸水浴煮沸5 min，加入0.5 ml 3.36 mmol/L鄰聯(lián)甲苯胺，加入3.5 ml 0.1 mol/L HAC緩沖液（pH 4.6），在30 ℃條件下反應(yīng)30 min，在600 nm處測OD值，作為空白對照。

1.2.3營養(yǎng)條件優(yōu)化。

1.2.3.1單因素試驗(yàn)。按基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方，分別選用利于滑菇生長的碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘露醇）、氮源（蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、酒石酸銨、硝酸銨）、金屬離子（Mn2+、Cu2+、Fe2+、Na+、Ca2+）和pH （3、5、6、7、8）進(jìn)行碳源、氮源、金屬離子和pH的單因素篩選試驗(yàn)，以得到最佳碳源、氮源、金屬離子和pH。

1.2.3.2響應(yīng)面設(shè)計(jì)法（RSM）優(yōu)化滑菇產(chǎn)酶條件[6-7]。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對滑菇液體深層產(chǎn)漆酶的4種因素在3個(gè)水平上進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。選用N=29的RSM設(shè)計(jì)。每個(gè)因素取3個(gè)水平，每個(gè)水平重復(fù)3次。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。用Design Expert 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

1.2.4滑菇漆酶性質(zhì)的初步研究[8]。

1.2.4.1溫度對漆酶活性、熱穩(wěn)定性的影響。在不同溫度（10、20、30、40、50、60 ℃）下，按上述方法測定漆酶活力。粗酶液在上述溫度下保溫60 min后，按常規(guī)方法測定漆酶活性，以沒有經(jīng)過保溫處理的漆酶活性作為對照，計(jì)算剩余酶活。

1.2.4.2pH對漆酶活性、穩(wěn)定性的影響。分別采用不同pH（4.0、4.4、4.6、4.8、5.2、5.6、6.0）的乙酸-乙酸鈉（0.2 mol/L）緩沖液配制底物和稀釋酶液，按常規(guī)方法測定漆酶活力。然后，將粗酶液在上述pH環(huán)境中維持60 min （30 ℃），在溫度為30 ℃時(shí)測定漆酶活力，以沒有經(jīng)過預(yù)處理的漆酶活性為對照，計(jì)算剩余酶活性。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)由圖1可知，在液體培養(yǎng)過程中，滑菇漆酶的產(chǎn)生時(shí)間和酶活變化都有很大的差異。在培養(yǎng)初期，經(jīng)過短暫的適應(yīng)期后漆酶活性迅速升高，并且在第10天左右酶活達(dá)到最高，隨后逐漸下降。這可能是因?yàn)樵诮臃N初期，由于菌絲量較少，其分泌的漆酶量較低，隨著菌絲體量的增加，分泌漆酶的量也在增加。以不同的碳源（20 g/L）代替基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的葡萄糖。圖1A顯示，以葡萄糖為碳源有利于漆酶的合成。原因可能是葡萄糖能夠快速、有效地被菌絲體所利用，產(chǎn)生食用菌生長所需要的能量[9]。圖1B顯示，以不同的氮源（2.5 g/L）代替來培養(yǎng)菌體，該菌種對硝酸銨、酒石酸銨這樣的無機(jī)氮源利用率較差，而蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等有機(jī)氮源有利于漆酶的合成和積累。這可能是由于無機(jī)氮源較難穿過食用菌的細(xì)胞膜[10]。在有機(jī)氮源中，以蛋白胨為最佳氮源，能明顯提高漆酶產(chǎn)量。在以葡萄糖為碳源，以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中，分別添加不同的金屬離子（1.5 mmol/L）。圖1C顯示，Cu2+優(yōu)于其他4種離子，對漆酶的產(chǎn)生具有明顯的促進(jìn)作用。有研究表明，Cu2+的促進(jìn)作用可能與漆酶的結(jié)構(gòu)有一定關(guān)系，并且能顯著提高其他一些木腐菌漆酶的產(chǎn)生[11-12]。以葡萄糖為碳源，以蛋白胨為氮源，深層培養(yǎng)滑菇。圖1D顯示，pH為5的酸性環(huán)境最有利于漆酶的合成、分泌。pH的高低能夠影響酶活性中心的結(jié)構(gòu)、底物的表面結(jié)構(gòu)等，進(jìn)而影響漆酶的活性、分泌量[13]。

注：A.碳源；B.氮源；C.金屬離子；D.pH。

2.3溫度對漆酶活性、穩(wěn)定性的影響由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高，漆酶活力升高，并且當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，酶活達(dá)到最高值（354 U）。剩余酶活表明，漆酶活性在20～30 ℃之間保持相對穩(wěn)定。溫度過低或過高，酶活損失均很嚴(yán)重，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，其剩余酶活僅為22.5%，說明漆酶對溫度很敏感。

2.4pH對漆酶活性、穩(wěn)定性的影響采用不同pH的緩沖液，按常規(guī)的方法測定漆酶活力。由圖4可知，pH在4.4～5.2之間酶活力相對較高，并且當(dāng)pH為4.8時(shí)，漆酶活性42卷4期姚良同等滑菇Pholiota nameko SW01菌株產(chǎn)漆酶營養(yǎng)條件及部分3結(jié)論

該研究首先采用單因素試驗(yàn)方法，得到最適合滑菇產(chǎn)漆酶的碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨，pH為5，最適離子為Cu2+。在響應(yīng)面分析中，建立了以漆酶酶活為響應(yīng)值的全圖3溫度對漆酶酶活、穩(wěn)定性的影響圖4pH對漆酶酶活、穩(wěn)定性的影響變量二次回歸方程模型，最終得到最佳的產(chǎn)漆酶條件為葡萄糖42.50 g/L，蛋白胨2.10 g/L，pH 5.47，Cu2+濃度1.67 mmol/L。該條件下的酶活為943.27 U。驗(yàn)證試驗(yàn)說明，該模型可用。在漆酶的性質(zhì)試驗(yàn)中，漆酶的最適反應(yīng)溫度為30 ℃，最適反應(yīng)pH為4.8。熱穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，漆酶對溫度較敏感，當(dāng)溫度大于40 ℃時(shí)漆酶的穩(wěn)定性迅速下降。pH穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，漆酶在弱酸環(huán)境中均能發(fā)揮較高的活性。

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