張繼萬，周建麗，張曉芳，羅麗莎，王海濱

2種PCR試劑盒定量檢測血清HBV DNA含量的比較

張繼萬，周建麗，張曉芳，羅麗莎，王海濱

目的探討AMPLIPREP-COBASTAQMAN法（羅氏COBAS法）和北京鑫諾美迪PCR-熒光探針“一管法”檢測血清HBV DNA含量的性能差異。方法采用2種方法同步檢測175例乙型肝炎患者血清樣本，并將黃疸、溶血和脂血標本作為干擾樣本，分析2種方法的相關性、一致性和抗干擾性。取一已知定量為2.24×109IU/ml的標本，用陰性血清做1+9（即1∶10）的稀釋，并依次稀釋至2.24×10 IU/ml，比較2種方法的線性范圍和靈敏性的差異。結果175份均有數(shù)值的標本中，2種試劑檢測結果比較差異無統(tǒng)計學意義。2種試劑對黃疸、溶血和脂血標本的定量值影響不大。對于HBV DNA＞1.70×108IU/m l的樣本，羅氏COBAS法結果只顯示＞1.70×108IU/m l，而“一管法”無須稀釋仍能準確定量；對于HBVDNA＜1.00×102IU/m l的樣本，“一管法”僅能檢測到病毒，而羅氏COBAS法的穩(wěn)定性和線性更好。結論PCR-熒光探針“一管法”與進口羅氏COBAS法具有良好的一致性，且省時、省力，價格低廉，適合在我國推廣應用。

DNA，病毒；乙型肝炎，慢性；試劑盒，診斷

全球約有20多億人既往感染過HBV，其中約3.5億為慢性HBV感染者[1]。我國是乙型肝炎（乙肝）大國，人群乙肝表面抗原陽性率約7.18%，嚴重影響我國人口健康，因此切實提高乙肝臨床診療水平具有十分重要的意義[2]。由于發(fā)病人數(shù)眾多，結合國情尋找價廉而療效肯定的藥物以及能滿足臨床需求的檢測項目，具有非常重要的現(xiàn)實意義。本文對進口全自動HBV DNA定量技術和國產(chǎn)“一管法”試劑盒的準確性和靈敏性等指標進行比較研究，評價2種方法在我國不同層次醫(yī)院應用的地位，為臨床檢測項目的選擇提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料175份乙肝血清樣本來自于解放軍第三〇二醫(yī)院門診及住院患者，用2種方法同時檢測。

1.2 黃疸、溶血和脂血標本的選擇與制備

1.2.1 對照樣本的選擇分別選擇HBV DNA含量為1.00×109IU/ml、1.00×106IU/ml和1.00×104IU/ml無黃疸、溶血和脂血的血清為對照樣本。采用無黃疸、溶血和脂血的HBV DNA陰性血清為稀釋液，按照1┼4（即1∶5稀釋）比例制備實驗對照血清。

1.2.2 含黃疸、溶血和脂血干擾血清的制備選擇HBV DNA陰性的高黃疸（TBIL＞500μmol/L）、高脂血（TG＞5.5mmol/L）和全血凍融的標本為稀釋液，分別對對照血清做1┼4稀釋，制備出含有黃疸、溶血和脂血的高、中、低拷貝的干擾標本。

1.3 主要試劑和儀器采用羅氏AMPLIPREP-COBASTAQMAN法（以下簡稱“羅氏COBAS法”）全自動核酸提取和擴增系統(tǒng)，檢測下限為20.00 IU/ml，以及北京鑫諾美迪PCR-熒光“一管法”，最低檢測下限為5.00×102IU/ml，采用上海宏石公司SLAN熒光定量儀進行擴增。

1.4 HBV DNA定量檢測

1.4.1 羅氏COBAS法加1ml血清到樣本管，然后將磁珠、裂解液和洗液等試劑放入儀器中指定位置。當DNA在高溫（80℃）洗脫后，儀器自動將反應液加入提取的核酸中。最后，在PCR擴增儀進行擴增。

1.4.2 “一管法”在PCR反應管底分別加入3μl“核酸釋放劑”，然后加入3μl標準品、質控品和待檢樣本，吸打混勻，95℃靜置10min，加入35μl的PCR反應液進行PCR擴增。

1.5 統(tǒng)計學處理應用SPSS l7.0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析。計量資料呈正態(tài)分布，以±s表示，2組間比較采用成組t檢驗。組間計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或精確概率檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2種方法相關性比較在175份樣本中，對2種方法檢測HBV DNA定量＞5.00×102IU/m l的90份進行相關分析，二者的相關系數(shù)為0.948（圖1）。

圖1 羅氏COBAS法和“一管法”HBV DNA定量相關性比較Figure 1 Com parison of the correlation of HBV DNA quantification by Roche COBAS TaqM an HBV assay and one-tube nested PCR assay

2.2 2種方法一致性比較按目前臨床通用臨界值5.00×102IU/m l進行2種方法的一致性分析，＞5.00×102IU/ml的標本為陽性，＜5.00×102IU/ml的標本為陰性。在175份血清樣本中，2種方法檢測結果均為陽性的標本有90份，均為陰性的標本有76份。二者陽性符合率為94.74%，陰性符合率為95.00%，粗一致性為94.85%（表1）。

表1 2種方法一致性比較(份)Table 1 Comparison of the consistency between the two assay methods（sam ples）

2.3 2種方法定量范圍和靈敏性比較選取1份HBV DNA定量＞1.00×109IU/ml的強陽性樣本（經(jīng)HBV核酸國家標準品定值），用陰性血清做1┼9（即1∶10）的稀釋，然后用2種方法進行定量。結果表明，對于濃度為1.00×102IU/m l～1.70×108IU/ml的樣本，2種試劑的定量結果與理論靶值均具有良好的一致性，二者的平均值與理論濃度的對數(shù)線性相關系數(shù)分別為0.999 5和0.999 4；對于＜1.00×102IU/ml的樣本，“一管法”能檢測到病毒，但定量值不再呈10倍遞減，羅氏COBAS法仍呈10倍遞減；對于＞1.70×108IU/ml的樣本，羅氏COBAS法結果只顯示＞1.70×108IU/ml（若要精確的定量值，須稀釋后再做），“一管法”仍呈10倍遞增，可準確定量HBV DNA含量高于8個數(shù)量級以上的臨床樣本，而無須稀釋（表2、圖2）。

表2 2種試劑檢測梯度稀釋樣本定量結果比較(IU/m l)Table 2 Comparison of HBV DNA quantification between the two assay methods（IU/m l）

2.4 2種方法檢測黃疸、溶血和脂血標本的結果比較含有黃疸、溶血和脂血的HBV DNA陽性標本對2種不同核酸提取方法進行的熒光PCR結果都產(chǎn)生不同程度的影響。黃疸標本對“一管法”的擴增效率產(chǎn)生的影響最大，脂血標本影響最?。▓D3）。含有黃疸、溶血和脂血的HBV DNA陽性標本對熒光PCR定量結果影響不大，因其Ct值僅有細微差別。

3 討論

我國在全球范圍內(nèi)首先將HBV DNA定量指標列為臨床抗病毒治療的參考指標，在乙肝抗病毒治療方面具有豐富經(jīng)驗[3-6]。核苷（酸）類似物等抗病毒藥物的廣泛應用，可降低患者的血清病毒含量，因此臨床對HBV DNA檢測的靈敏性要求越來越高[7-10]。近幾年國產(chǎn)試劑盒的質量一直穩(wěn)步提升，其檢測靈敏度也由5年前的＜1.00×103IU/ml，提升到1.00×102～5.00×102IU/ml，并且檢測結果與國際通用技術具有一定的可比性。羅氏COBAS法在檢測中使用的血清量為500μl，而“一管法”僅使用3μl，因此有前者的靈敏度要高于后者166.7（500/3）倍的視覺，但在實際研究中并未發(fā)現(xiàn)這樣的差異[11-13]。研究表明，血清量的增加除了能提高視覺上的靈敏度外，還存在被大家忽視的PCR干擾物質如蛋白及離子等呈倍數(shù)增加[14]，而且核酸提取過程中核酸丟失的問題亦容易被忽略。研究指出，磁珠的核酸丟失可高達90%以上[15]?！耙还芊ā敝苯訉?μl血清加入PCR反應管中，經(jīng)過蛋白溫度變性處理即進行PCR擴增，3μl之所以可對5.00× 102IU/ml（約3×103copies/ml）的血清標本進行定量，一則無核酸丟失，二則其理論靈敏度為50 IU/ml（約3×102copies/ml），完全可滿足目前臨床檢測需求。

圖2 “一管法”10倍梯度稀釋擴增曲線Figure 2 Am plification curves for 10-fold dilution series by one-tube nested PCR assay

圖3 “一管法”提取高、中、低拷貝干擾血清的擴增曲線Figure 3 Amp lification curves for high,medium and low levels of HBV DNA in interference sera by one-tube nested PCR assay

本文對175份血清標本進行研究的結果提示，二者均具有良好的相關性、較好的一致性和優(yōu)秀的抗干擾性能。羅氏COBAS法有5項標本定量為＞5.00×102IU/ml，而“一管法”定量為＜5.00× 102IU/ml；反之，“一管法”有4項標本定量為＞5.00×102IU/m l，羅氏COBAS法定量為＜5.00× 102IU/ml。重復檢測發(fā)現(xiàn)，這9份標本全部為臨界值。因此對臨床需求的5.00×102～1.00×108IU/m l的標本而言，2種方法均能準確滿足。對HBV DNA含量＞1.00×108IU/ml的血清標本，“一管法”可無須稀釋標本即可提供準確結果，羅氏COBAS法卻無法實現(xiàn)，而臨床對高次方標本的HBV DNA需求并不十分強烈。羅氏COBAS法的優(yōu)勢是對HBV DNA含量＜5.00×102IU/m l的標本進行準確定量，其定量靈敏度高達20.00 IU/ml。按2005年專家共識的要求，建議對血清HBV DNA含量＞2.00×104IU/ml的患者行核苷類似物治療[16]。因此具有較高靈敏度的試劑盒臨床使用價值并不高，但因臨床醫(yī)生和患者對治療結果的“挑剔”，提高試劑盒的靈敏度符合現(xiàn)實需求。

“一管法”病原體核酸熒光定量PCR檢測法與羅氏COBAS法相比，除了價格低，耗時短外，還具有抗干擾性能良好，高含量HBV DNA標本無須稀釋，操作簡便，污染概率低等優(yōu)勢。雖然低拷貝樣本中的穩(wěn)定性及線性欠佳，但結合我國國情，適合臨床檢測，值得推廣。

[1]申煥軍，陳敬銀，張中偉，等.慢性乙型肝炎患者HBV血清標志物與HBVDNA的相關性分析［J］.傳染病信息，2013，26(2):111-114.

[2]中華醫(yī)學會肝病學分會，中華醫(yī)學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）［J］.傳染病信息，2011，24(1):Ⅲ-ⅩⅤ.

[3]Su H,Zhang Y,Xu D,et al.Occult hepatitis B virus infection in anti-HBs-positive infants born to HBsAg-positive mothers in China［J］.PLoSOne,2013,8(8):e70768.

[4]Morris CJ,Hill M,de Medina M,et al.Comparison of detection and quantification of HBV DNA in chronic HBeAg negative and positive patients by Abbott RealTime HBV and Roche Cobas TaqMan HBV assays［J］.JVirol Methods,2013,193(2):391-393.

[5]Ntziora F,Paraskevis D,Haida C,etal.Ultrasensitive amplification refractory mutation system real-time PCR(ARMS RT-PCR)assay for detection of minority hepatitis B virus-resistant strains in the era of personalizedmedicine［J］.J Clin Microbiol,2013,51(9): 2893-2900.

[6]Kim H,Shin S,Oh EJ,et al.Comparison of the AdvanSure HBV real-time PCR test with three other HBV DNA quantification assays［J］.Ann Clin Lab Sci,2013,43(2):230-237.

[7]Katsoulidou A,Manesis E,Rokka C,et al.Development and assessment of a novel real-time PCR assay for quantitation of hepatitis D virus RNA to study viral kinetics in chronic hepatitis D［J］.JViral Hepat,2013,20(4):256-262.

[8]Loustaud-Ratti V,Wagner A,Carrier P,etal.Distribution of total DNA and cccDNA in serum and PBMCs may reflect the HBV immune status in HBsAg+and HBsAg-patients coinfected or not with HIV or HCV［J］.Clin Res Hepatol Gastroenterol,2013,37(4): 373-383.

[9]Park Y,Kim BS,Choi KH,etal.A novelmultiplex real-time PCR assay for the concurrent detection of hepatitis A,B and C viruses in patientswith acutehepatitis［J］.PLoSOne,2012,7(11):e49106.

[10]Germer JJ,Abraham P,Mandrekar JN,et al.Evaluation of the AbbottHBVRUOsequencing assay combinedwith laboratory-modified interpretive software［J］.JClin Microbiol,2013,51(1):95-100.

[11]Afshar RM,Mollaie HR.Detection of HBV resistance to lamivudine in patients with chronic hepatitis B using Zip nucleic acid probes in Kerman,southeastof Iran［J］.Asian Pac JCancer Prev,2012,13 (8):3657-3661.

[12]Izmirli S,Celik DG,Yuksel P,et al.The detection of occult HBV infection in patients with HBsAg negative pattern by real-time PCRmethod［J］.Transfus Apher Sci,2012,47(3):283-287.

[13]Shen ZY,Zheng WP,Deng YL,et al.Variations in the S and P regions of the hepatitis B virus genome under immunosuppression in vitro and in vivo［J］.Viral Immunol,2012,25(5):368-378.

[14]Tas T,Kaya S,Onal S,et al.The detection of HBV DNA with polymerase chain reaction in blood donors with isolated hepatitis B core antibody［J］.Med Glas(Zenica),2012,9(2):227-230.

[15]Blackard JT,Martin CM,Sengupta S,et al.Limited infection with occult hepatitis B virus in drug users in the USA［J］.Hepatol Res, 2013,43(4):413-417.

[16]Liaw YF,Leung N,Guan R,et al.Asian-Pacific consensus statement on themanagement of chronic hepatitis B:a 2005 update［J］. Liver Int,2005,25(3):472-489.

（2014-05-11收稿 2014-06-27修回）

（責任編委 王永怡 本文編輯 陳玉琪）

Comparison of two PCR assays for serum HBV DNA quantification

ZHANG Ji-wan,ZHOU Jian-li,ZHANG Xiao-fang,LUO Li-sha,WANG Hai-bin*
Department of Infectious Diseases,Sichuan Provincial Corps Hospital, Chinese People's Armed Police Forces,Leshan,Sichun 614000,China
*Corresponding author,E-mail:haibin_wang@sohu.com

Objective To investigate the performance differences in detecting serum HBV DNA quantification between Roche COBASTaqMan HBV assay and one-tube nested PCR assay.Methods The serum samples from 175 patientswith hepatitis B were detected by Roche COBASTaqMan HBV assay and one-tube nested PCR assay,with the jaundice,hemolytic and lipemic samples as interference samples,so as to analyze the correlation,consistency and interference performance of the two assays.A known sample with 2.24×109IU/ml of HBV DNA was diluted by 1∶10 in negative serum in turn,and finally to an HBV DNA level of 2.24×10 IU/ m l.The linear range and sensitivity of the two assays were analyzed.Results There was no significant difference in HBV DNA quantification of the 175 samples detected by the two assays.HBV DNA quantification in the jaundice,hemolytic and lipemic samples detected by the two assays was not significantly different.For samples with HBV DNA＞1.70×108IU/ml,Roche COBAS TaqMan HBV assay only showed HBV DNA level of＞1.70×108IU/m l,but HBV DNA could be accurately quantified without being diluted by one-tube nested PCR assay.For sampleswith HBV DNA＜1.00×102IU/ml,one-tube nested PCR assay could only detect the virus,but Roche COBASTaqMan HBV assay had better stability and linearity.Conclusions The detection result of HBV DNA quantification by one-tube nested PCR assay is consistent with that by Roche COBAS TaqMan HBV assay,and one-tube nested PCR assay,as a timesaving,laborsaving,and cheap method for quantifying HBV DNA levels,is suitable for application in China.

DNA,viral;hepatitis B,chronic;reagent kits,diagnostic

R342.4；R512.62

A

1007-8134(2014)04-0219-04

軍隊“十二五”面上課題（CWJ11J298）

614000樂山，武警四川省總隊醫(yī)院傳染科（張繼萬、周建麗、張曉芳、羅麗莎）；100039北京，解放軍第三〇二醫(yī)院臨床檢驗醫(yī)學中心（王海濱）

王海濱，E-mail:haibin_wang@sohu.com